Cinética enzimática

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Imagem gerada por computador de um modelo da estrutura tridimensional da enzima purina nucleósido fosforilase bacteriana.

A cinética enzimática estuda as reacções químicas catalisadas pelas enzimas, em especial a velocidade de reacção. O estudo da cinética de uma enzima permite elucidar os pormenores do seu mecanismo catalítico, o seu papel no metabolismo, como é controlada a sua actividade na célula e como pode ser inibida a sua actividade por drogas ou venenos, ou potenciada por outro tipo de moléculas.

Introdução[editar | editar código-fonte]

Enzimas[editar | editar código-fonte]

As enzimas são macromoléculas com a capacidade de manipular outras moléculas, denominadas substratos. Um substrato pode unir-se ao centro catalítico da enzima que o reconheça e transformar-se num produto ao longo de uma série de passos denominados mecanismo enzimático. Algumas enzimas podem unir vários substratos diferentes e/ou libertar diversos produtos, como é o caso das proteases ao romper uma proteína em dois polipéptidos. Noutros casos, produz-se a união simultânea de dois substratos, como no caso da DNA polimerase, que é capaz de incorporar um nucleótido (substrato 1) a uma cadeia de ADN (substrato 2). Embora todos estes mecanismos sigam usualmente uma complexa série de passos, também podem apresentar um passo limitante que determina a velocidade final de toda a reacção. Este passo limitante pode consistir numa reacção química ou numa mudança de forma da enzima ou do substrato.

O conhecimento adquirido acerca da estrutura das enzimas é útil na interpretação dos dados cinéticos. Por exemplo, a estrutura pode sugerir como permanecem unidos substrato e produto durante a catálise, que mudanças de forma ocorrem durante a reacção, ou mesmo o papel em particular de determinados aminoácidos no mecanismo catalítico. Algumas enzimas modificam a sua forma significativamente durante a reacção, em cujo caso pode ser crucial saber a estrutura molecular da enzima com e sem substrato unido (costumam usar-se análogos que se unem mas não permitem levar a cabo a reacção e mantêm a enzima permanentemente na forma de substrato unido).

Os mecanismos enzimáticos podem ser divididos em mecanismos de substrato único e mecanismos de múltiplos substratos. Os estudos cinéticos com enzimas que apenas unem um substrato, como a triose-fosfato isomerase, visam a medir a afinidade com a que se une o substrato e a velocidade com que o transforma em produto. Por outro lado, ao estudar una enzima que une vários substratos, como a di-hidrofolato redutase, a cinética enzimática pode mostrar também a ordem pela qual se unem os substratos e se libertam os produtos.

Nem todas as catálises biológicas são efectuadas por enzimas proteicas. Existem moléculas catalíticas baseadas no ARN, como as ribozimas e os ribossomas, essenciais para o splicing alternativo e a tradução do ARNm, respectivamente. A principal diferença entre as ribozimas e os ribossomas radica no limitado número de reacções que as primeiras podem efectuar, embora os seus mecanismos de reacção e as suas cinéticas possam ser estudados e classificados pelos mesmos métodos.

Princípios gerais[editar | editar código-fonte]

A velocidade de reacção aumenta com a concentração do substrato, eventualmente ficando a enzima saturada a altas concentrações de substrato.

A reacção catalisada por uma enzima utiliza a mesma quantidade de substrato e gera a mesma quantidade de produto que uma reação não catalisada. Tal como ocorre noutros tipos de catálise, as enzimas não alteram em absoluto o equilíbrio da reacção entre substrato e produto.[1] Ao contrário do que acontece noutras reacções químicas, as enzimas saturam-se. Isto significa que com uma maior quantidade de substrato, mais centros catalíticos estarão ocupados, o que incrementará a eficiência da reacção, até ao momento em que todos os sítios possíveis estejam ocupados. Nesse momento ter-se-á alcançado o ponto de saturação da enzima e, embora se adicione mais substrato, não aumentará mais a eficiência.

As duas propriedades cinéticas mais importantes de uma enzima são: o tempo que demora a saturar-se com um substrato em particular e o seu ponto máximo de saturação. O conhecimento destas propriedades torna possível formular hipóteses sobre o comportamento de uma enzima no ambiente celular e prever como responderá frente a mudanças nessas condições.

Ensaios enzimáticos[editar | editar código-fonte]

Ensaios enzimáticos são procedimentos laboratoriais que medem a velocidade de reacções enzimáticas. Uma vez que as enzimas não são consumidas pelas reacções que catalisam, nos ensaios seguem-se habitualmente mudanças na concentração de substratos ou produtos para medir a taxa de reacção. Há vários métodos de medida: os ensaios espectrofotométricos medem a mudança de absorbância da luz entre produtos e reagentes; ensaios radiométricos envolvem a incorporação ou libertação de radioactividade para medir a quantidade de produto que surge ao longo do tempo. Os ensaios espectrofotométricos são mais convenientes pois permitem a medição contínua da velocidade de reacção. Embora os ensaios radiométricos exijam a remoção e contagem de amostras (ou seja, são ensaios descontínuos), são habitualmente de grande sensibilidade e podem medir vários níveis da actividade enzimática.[2] Uma abordagem análoga é usada na espectrometria de massa para aferir a incorporação ou libertação de isótopos estáveis à medida que o substrato é convertido em produto.

Os ensaios enzimáticos mais sensíveis usam lasers focados por um microscópio para observar mudanças em moléculas enzimáticas individuais à medida que decorre a reacção. Estas medidas usam geralmente mudanças na fluorescência de cofactores durante o mecanismo de reacção, ou fluoróforos adicionados a locais específicos da proteína que registam movimentos que ocorrem durante a catálise.[3] Estes estudos fornecem um novo panorama sobre a cinética e dinâmica de moléculas individuais, em oposição à tradicional cinética enzimática, que observa o comportamento médio de populações com milhões de moléculas enzimáticas.[4] [5]

Reacções mono-substrato[editar | editar código-fonte]

Entre as enzimas com mecanismos mono-substrato incluem-se as isomerases como a triose-fosfato isomerase ou bisfosfoglicerato mutase, liases intramoleculares como a adenilato ciclase e a ribozima, uma liase de RNA.[6] Porém, algumas enzimas que apenas têm um substrato não se agrupam nesta categoria de mecanismos. A catalase é um exemplo, pois reage com uma molécula de substrato de peróxido de hidrogénio, oxida-se e é então reduzida por uma segunda molécula de substrato. Embora um único substrato esteja envolvido, a existência de um intermediário que é uma enzima modificada significa que o mecanismo de catálise é um mecanismo ping-pong (tipo de mecanismo discutido mais abaixo).

Cinética de Michaelis–Menten[editar | editar código-fonte]

Curva de saturação para uma enzima mostrando a relação entre a concentração do substrato (abcissas) e a velocidade de reacção (ordenadas).

As reacções catalisadas por enzimas são saturáveis, e a sua velocidade de catálise não indica uma resposta linear face ao aumento de substrato. Se a velocidade inicial da reacção é medida sobre uma escala de concentrações de substrato (denotada como [S]), a velocidade de reacção (v) aumenta com o acréscimo de [S]. Todavia, à medida que [S] aumenta, a enzima satura-se e a velocidade atinge o valor máximo Vmax.

No modelo da cinética de Michaelis-Menten de uma reacção mono-substrato existe uma reacção bimolecular inicial entre a enzima E e o substrato S para formar o complexo ES. Embora o mecanismo enzimático para a reacção unimolecular ES \rightarrow E + P possa ser bastante complexo, há tipicamente um passo na determinação da velocidade que permite que se modele o mecanismo como um passo catalítico simples de velocidade constante k2.

\begin{matrix}v = k_2 [\mbox{ES}]\end{matrix} (Eq. 1).

k2 também é designado como kcat ou turnover, o valor máximo de reacções enzimáticas catalisadas por segundo.

Com baixas concentrações de substrato [S], a enzima permanece em equilíbrio entre a forma livre E e o complexo enzima-substrato ES; aumentando [S] aumenta [ES] à custa de [E], mudando o equilíbrio para o lado direito. Uma vez que a velocidade de reacção depende da concentração [ES], a velocidade é sensível a pequenas alterações de [S]. Todavia, com altos valores de [S], a enzima fica totalmente saturada com substrato, e existe apenas na forma ES. Nestas condições, a velocidade (vk2[E]tot=Vmax) é insensível a pequenas alterações de [S]; assim, [E]tot é a concentração total enzimática


[\mbox{E}]_\mathrm{tot} \ \stackrel{\mathrm{def}}{=}\  [\mbox{E}] + [\mbox{ES}]

que é aproximadamente igual à concentração [ES] em condições de saturação.

A equação de Michaelis–Menten[7] descreve como a velocidade de reacção v depende da posição do equilíbrio ligado ao substrato e da constante de velocidade k2. Michaelis e Menten mostraram que se k2 for bem menor que k-1 (chamada a aproximação de equilíbrio), pode obter-se a seguinte equação:

 v = \frac{V_\max[\mbox{S}]}{K_m + [\mbox{S}]} (Eq. 2)

Esta equação de Michaelis-Menten é a base da maior parte da cinética enzimática mono-substrato.

A constante de Michaelis Km é definida como a concentração para a qual a velocidade da reacção enzimática é metade de Vmax. Isto pode verificar-se ao substituir Km = [S] na equação de Michaelis-Menten. Se o passo de determinação da velocidade for lento, quando comparado com a dissociação do substrato (k2 << k-1), então a constante de Michaelis Km é aproximadamente à constante de dissociação do complexo ES, embora tal situação seja relativamente rara.

A situação mais normal dá-se quando k2 > k-1 na por vezes chamada cinética de Briggs-Haldane.[8] A equação ainda se verifica em condições mais gerais, como provém da aproximação ao estado estacionário. Durante o período inicial, a velocidade de reacção v é relativamente constante, indicando que [ES] é também aproximadamente constante (cf. equação 1):


\frac{d}{dt}[\mbox{ES}] = k_{1} [\mbox{E}][\mbox{S}] - k_{2}[\mbox{ES}] - k_{-1}[\mbox{ES}] \approx 0

Assim, a concentração [ES] é dada pela fórmula


[\mbox{ES}] \approx \frac{[\mbox{E}]_\mathrm{tot} [\mbox{S}]}{[\mbox{S}] + K_{m}}

em que a constante de Michaelis Km é definida por


K_{m} \ \stackrel{\mathrm{def}}{=}\  \frac{k_{2} + k_{-1}}{k_{1}} \approx \frac{[\mbox{E}][\mbox{S}]}{[\mbox{ES}]}

([E] é a concentração de enzima livre). Em conjunto, a fórmula geral para a velocidade de reacção v vem pela equação de Michaelis-Menten:


v = k_{2} [\mathrm{ES}] = \frac{k_{2} [\mbox{E}]_\mathrm{tot} [\mbox{S}]}{[\mbox{S}] + K_{m}} = \frac{V_\max [\mbox{S}]}{[\mbox{S}] + K_{m}}

A constante de especificidade k_{cat}/K_{m} é uma medida da eficiência de conversão pela enzima do substrato em produto. Usando a definição da constante de Michaelis K_{m}, a equação escreve-se na forma


v = k_{2} [\mathrm{ES}] = \frac{k_{2}}{K_{m}} [\mbox{E}] [\mbox{S}]

sendo [E] a concentração de enzima livre. Assim, a constante de especificidade é um modo eficaz de obter a constante de segunda ordem da velocidade para enzimas livres na reacção com substrato livre para formação de produto. A constante de especificidade é limitada pela frequência com que o substrato e a enzima se encontram na solução, podendo atingir 1010 M−1 s−1.[9] Esta taxa máxima é amplamente não dependente da dimensão do substrato ou da enzima.[10] A razão entre constantes de especificidade para dois substratos é uma comparação quantitativa da eficiência da enzima na conversão dos substratos. O declive do gráfico de Michaelis-Menten com baixa concentração de substrato [S] (i.e. [S] << Km) também resulta na constante de especificidade.

Representação da equação de Michaelis-Menten[editar | editar código-fonte]

O gráfico de Lineweaver-Burke ou do duplo recíproco mostra o significado dos pontos de intercepção entre a recta e os eixos de coordenadas, e do gradiente da velocidade.

O gráfico de velocidade face a [S] mostrado anteriormente não é linear. Embora a baixas concentrações de substrato se mantenha linear, vai curvando à medida que aumenta a concentração de substrato. Antes da chegada dos computadores, que permitem ajustar regressões não lineares de forma simples, podia chegar a ser realmente difícil estimar os valores de Km e Vmax nos gráficos não lineares. Isto deu lugar a que vários investigadores concentrassem os seus esforços em desenvolver métodos de linearização da equação de Michaelis-Menten, dando como resultado o gráfico de Lineweaver-Burke, o diagrama de Eadie-Hofstee e o gráfico de Hanes-Woolf. Com o seguinte tutorial da cinética de Michaelis-Menten realizado na Universidade de Virgínia a, pode-se simular o comportamento de uma enzima variando as constantes cinéticas.

O gráfico de Lineweaver-Burk ou representação de duplo recíproco é a forma mais comum, e simples,de mostrar os dados cinéticos, apesar de não ser a mais fiável. Para tal, tomam-se os valores inversos de ambos os lados da equação de Michaelis-Menten. Como se pode apreciar na figura da direita, o resultado deste tipo de representação é uma linha recta cuja equação é e = mx + c, sendo o ponto de intercepção entre a recta e o eixo das ordenadas equivalente a 1/Vmax, e o ponto de intercepção entre a recta e o eixo de abcissas equivalente a -1/Km.

\frac{1}{v} = \frac{K_{m}}{V_{max} [\mbox{S}]} + \frac{1}{V_{max}}

Evidentemente não se podem tomar valores negativos para 1/[S]; o mínimo valor possível é 1/[S] = 0, que corresponderia a uma concentração infinita de substrato, e daí 1/v = 1/Vmax. O valor do ponto de intercepção entre a recta e o eixo x é uma extrapolação de dados experimentais obtidos em laboratório. Geralmente, os gráficos de Lineweaver-Burke distorcem as medidas realizadas a baixas concentrações de substrato e isto pode dar lugar a estimativas não muito exactas de Vmax e de Km.[11] Um modelo linear muito mais exacto é o diagrama de Eadie-Hofstee, mas nas investigações científicas actuais, todo este tipo de linearizações tornou-se obsoleto e foi substituído por métodos mais fiáveis baseados na análise de regressão não linear. Para analisar os dados é conveniente a normalização dos mesmos, já que isto pode ajudar à diminuição da quantidade de trabalho experimental a realizar e incremento da fiabilidade da análise.[12]

Importância prática das constantes cinéticas[editar | editar código-fonte]

O estudo da cinética enzimática é importante por duas razões principais. Em primeiro lugar, ajuda a explicar como as enzimas trabalham, e, em complemento, permite prever o comportamento das enzimas em organismos vivos. As constantes cinéticas acima definidas, Km e Vmax, são críticas na compreensão do modo de funcionamento conjunto das enzimas para controlar o metabolismo.

Fazer estas previsões não é trivial, mesmo para sistemas simples. Por exemplo, o oxaloacetato é formado pela malato desidrogenase no interior da mitocôndria e pode ser consumido pela citrato sintase, a fosfoenolpiruvato carboxiquinase ou a transaminase glutâmico-oxalacética, entrando no ciclo do ácido cítrico, gluconeogénese ou biossíntese do ácido aspártico, respectivamente.

A capacidade de previsão de quanto oxaloacetato segue cada via exige conhecimento da sua concentração e da concentração e cinética de cada uma das enzimas. Esta capacidade preditiva do comportamento metabólico atinge a sua expressão mais complexa na síntese de grandes quantidades de dados cinéticos e genéticos em modelos matemáticos de organismos inteiros. Embora este objectivo seja longínquo para qualquer eucariota, fazem-se tentativas para atingi-lo nas bactérias, com modelos do metabolismo da Escherichia coli.[13] [14]

Reacções multi-substrato[editar | editar código-fonte]

As reações multi-substrato seguem uma série de complexas equações que descrevem como se unem os substratos e em que ordem o fazem. A análises destas reações é muito mais simples se a concentração do substrato A se mantiver constante e a do substrato B variar. Nestas condições, a enzima se comporta igual a uma enzima de único substrato, pelo que num gráfico de velocidade a concentração do substrato dará um dos valores aparentes das constantes cinéticas, Km e Vmax, para o substrato B. Se se realizarem uma série de medidas a diferentes concentrações fixas de substrato A, os dados obtidos permitirão saber a que tipo de mecanismo pertence a reação enzimática. Para uma enzima que una dois substratos A e B, e os transforme em dois produtos P e Q, existem dois tipos de mecanismos descritos.

Mecanismos de complexo ternário[editar | editar código-fonte]

Mecanismo de complexo ternário para uma reacção enzimática. A enzima E une os substratos A e B e liberta os produtos P e Q em ordem não definida.

As enzimas (E) que apresentam este mecanismo de reacção unem ao mesmo tempo os dois substratos (A e B), dando lugar a um complexo ternário EAB. A ordem sequencial da união dos substratos pode ser ao acaso (mecanismo aleatório) ou seguir uma ordem em particular (mecanismo ordenado). Se fixar a concentração do substrato A e variar a de B, ao representar-se graficamente o comportamento da enzima mediante um diagrama de Lineweaver-Burke, obter-se-á uma série de rectas com um ponto de intersecção comum a todas elas.

Entre as enzimas que apresentam este mecanismo podemos encontrar a glutatião S-transferase,[15] a di-hidrofolato redutase[16] e a DNA polimerase.[17] As seguintes ligações mostram animações do mecanismo de complexo ternário da di-hidrofolato redutase β e da DNA polimerase γ.

Mecanismos ping–pong[editar | editar código-fonte]

Como se pode ver na figura da direita, as enzimas com um mecanismo de ping-pong podem apresentar dois estados: a conformação normal (E) e a conformação modificada quimicamente (E*) ou conformação intermédia. Nesse tipo de mecanismo, o substrato A une-se à enzima E, que passa a um estado intermediário E*, por exemplo, por transferência de um grupo químico ao centro activo da enzima, podendo já ser libertado na forma de produto P. Apenas quando o substrato A foi já libertado do centro activo da enzima se pode unir ao substrato B, que devolve a enzima modificada E* ao seu estado original E, e libertá-lo em forma de produto Q. Se se fixar a concentração de A e variar a de B, e se se representar graficamente uma enzima com mecanismo de ping-pong num diagrama de Lineweaver-Burke, obter-se-á uma série de rectas paralelas entre si.

Mecanismo de ping-pong para uma reação enzimática. A união dos substratos A e B tem lugar numa ordem definida e sequencial, por meio de um intermediário enzimático modificado, E*.

Entre as enzimas com este tipo de mecanismo encontram-se algumas oxirredutases, como a tiorredoxima peroxidase,[18] transferases, como a acilneuraminato citidilo transferase,[19] e proteases de serina, como a tripsina e a quimiotripsina.[20] As proteases de serina formam uma família diversa de enzimas muito comuns, que incluem enzimas digestivas (tripsina, quimiotripsina e elastase), várias enzimas do processo de coagulação e muitas outras. Nas proteases de serina, o estado intermediário E* é uma espécie acilada numa serina do centro catalítico da enzima. Mostra-se uma animação do mecanismo catalítico da quimiotripsina na ligação seguinte:δ.

Cinética não-michaeliana[editar | editar código-fonte]

Algumas reacções enzimáticas dão lugar a curvas do tipo sigmóide, ao ser representadas numa curva de saturação, o que pode indicar uma ligação cooperativa do substrato ao centro catalítico da enzima. Isto significa que a união de uma molécula de substrato influencia a união das moléculas de substrato posteriores. Este comportamento é o mais comum nas enzimas multiméricas, que apresentam diversas zonas de interacção com o substrato.[21] O mecanismo de cooperação é semelhante ao observado na hemoglobina. A união de una molécula de substrato a uma das zonas de interacção altera significativamente a afinidade pelo substrato das restantes zonas de interacção. As enzimas com este tipo de comportamento são denominadas alostéricas. A cooperatividade positiva tem lugar quando a primeira molécula de substrato unida incrementa a afinidade do resto de zonas de interacção. Pelo contrário, a cooperatividade negativa tem lugar quando a primeira molécula de substrato unida reduz a afinidade da enzima por novas moléculas de substrato.

Exemplos de enzimas com cooperatividade positiva incluem a aspartato transcarbamilase bacteriana [22] e a fosfofructoquinase,[23] e com cooperatividade negativa, a tirosilo-RNAt transferase de mamíferos.[24]

A cooperatividade é um fenómeno bastante comum e pode chegar a ser crucial na regulação da resposta enzimática a mudanças na concentração de substrato. A cooperatividade positiva faz que a enzima seja muito mais sensível à concentração de substrato. Com isto, a actividade pode chegar a variar fortemente, mesmo em intervalos muito estreitos de concentração de substrato. Pelo contrário, a cooperatividade negativa faz com que a enzima seja insensível a pequenas mudanças na concentração de substrato.

A equação de Hill [25] pode ser utilizada para descrever quantitativamente o grau de cooperatividade em cinéticas não michaelianas. O coeficiente de Hill (n) indica quantas das zonas de união de substrato de uma enzima afectam a afinidade da união do substrato no resto das zonas de união. O coeficiente de Hill pode tomar valores maiores ou menores que 1:

  • n < 1: indica cooperatividade negativa.
  • n > 1: indica cooperatividade positiva.

Cinética do estado pré-estacionário[editar | editar código-fonte]

Curva do progresso pré-estacionário, mostrando a fase inicial de uma reacção enzimática.

Ao realizar um ensaio enzimático e misturar a enzima com o substrato, existe um breve período inicial em que não se produz nem síntese de produto, nem estado intermédio da enzima. O estudo dos milissegundos seguintes à mistura é denominado cinética do estado pré-estacionário e está relacionado com a formação e consumo dos intermediários enzima-substrato (ES ou E*) até ao momento em que se alcançam certas concentrações e começa o estado estacionário.

A primeira enzima em que se estudou este processo, durante a reacção de hidrólise, foi a quimiotripsina.[26] A detecção de intermediários costuma ser a principal prova necessária para saber sob que mecanismo actua a enzima. Por exemplo, ao realizar um ensaio de cinética rápida de uma reacção enzimática governada por um mecanismo de ping-pong, pode seguir-se a libertação de produto P e medir a formação de intermediários enzimáticos modificados E*.[27] No caso da quimiotripsina, o intermediário enzimático é produzido por um ataque nucleofílico do substrato a uma serina do centro catalítico, o que gera uma forma intermediária acilada da quimiotripsina.

Na figura da direita, pode-se observar como a enzima passa rapidamente a um estado intermédio E* durante os primeiros segundos da reacção. Posteriormente, quando é alcançado o estado estacionário, a velocidade diminui. Esta primeira fase da reacção proporciona a taxa de conversão da enzima. Portanto, a quantidade de produto liberado durante esta fase (que pode obter-se prolongando a recta correspondente ao estado estacionário até cortar o eixo y) também dá a quantidade de enzima funcional presente no ensaio.[28]

Mecanismo químico[editar | editar código-fonte]

Um dos objectivos mais importantes no estudo da cinética enzimática é determinar o mecanismo químico que subjaza na reacção enzimática, por exemplo, determinar a sequência ordenada de eventos que ocorrem na transformação de substrato em produto. As aproximações cinéticas discutidas anteriormente podem proporcionar informação relacionada com a velocidade de reacção dos intermediários enzimáticos formados, mas não irão permitir identificar que intermediários são formados.

Com o intuito de determinar a etapa limitante da reacção ou os intermediários que se formam durante a mesma, podem fazer-se ensaios enzimáticos em diversas condições com enzimas ou substratos ligeiramente modificados, que tragam dados relacionados. Um exemplo característico de etapa limitante de uma reacção é aquela na qual se rompe uma ligação covalente dando lugar a um átomo de hidrogénio. Se se trocar cada átomo de hidrogénio pelo seu isótopo estável, o deutério, poderemos saber qual dos possíveis hidrogénios transferidos é o que determina a etapa limitante. A velocidade sofrerá uma variação quando o hidrogénio crítico seja substituído, devido ao efeito isotópico cinético primário, cuja origem se encontra na maior estabilidade das pontes de deutério, mais difíceis de romper que as de hidrogénio.[29] Também é possível medir efeitos similares por meio de outras substituições isotópicas, tais como 13C/12C ou 18O/16O, mas os efeitos produzidos nestes casos são mais difíceis de detectar.

Os isótopos também podem ser utilizados para obter informação sobre o destino de diversas partes da molécula de substrato quando este é transformado em produto. Por exemplo, por vezes é difícil determinar a origem de um átomo de oxigénio no produto final, já que pode vir da água ou da molécula de substrato. Isto pode resolver-se mediante a substituição sistemática dos átomos de oxigénio das moléculas que participem na reacção, pelo seu isótopo estável 18O, fazendo depois uma procura do isótopo no produto obtido. O mecanismo químico também pode ser elucidado estudando os efeitos cinéticos e isotópicos sob diferentes condições de pH,[30] alterando os níveis de iões metálicos ou outros cofactores,[31] por mutagénese dirigida de aminoácidos conservados, ou pelo estudo do comportamento da enzima na presença de análogos do substrato.

Inibição enzimática[editar | editar código-fonte]

Esquema cinético para inibidores enzimáticos reversíveis. E=Enzima; S=Substrato; ES=Complexo; P=Produto; I=Inibidor

Os inibidores enzimáticos são moléculas que reduzem ou eliminam a actividade das enzimas. Podem encontrar-se dois tipos, os reversíveis (quando a remoção do inibidor restaura a actividade enzimática) e os irreversíveis (quando o inibitor inactiva de modo permanente a enzima).

Inibidores reversíveis[editar | editar código-fonte]

Os inibidores enzimáticos reversíveis podem ser classificados como competitivos, acompetitivos, não-competitivos e mistos, segundo o efeito que produzam nas constantes cinéticas Km e Vmax. Este efeito dependerá da união do inibidor à enzima E, ao complexo enzima-substrato ES ou a ambos, como se pode observar na figura e na tabela abaixo. Para classificar correctamente um inibidor pode-se estudar a sua cinética enzimática em função da concentração de inibidor. Os quatro tipos de inibição dão lugar a diagramas de Lineweaver-Burke e de Eadie-Hofstee [11] que variam de diferente forma com a concentração de inibidor. Para abreviar, usam-se dois símbolos:

 \alpha = 1 + \frac{[\mbox{I}]}{K_{i}} y \alpha^{\prime} = 1 + \frac{[\mbox{I}]}{K_{i}^{\prime}}

onde Ki e K'i são as constantes de dissociação para se unir à enzima e ao complexo enzima-substrato, respectivamente. Na presença de um inibidor reversível, os valores aparentes de Km e Vmax passam a ser (α/α')Km e (1/α')Vmax, respectivamente, como se pode ler na tabela abaixo para os casos mais comuns.

Tipo de inibição Km aparente Vmax aparente
apenas Ki (\alpha^{\prime}=1) competitiva K_m \alpha~ ~V_{max}~
apenas Ki' (\alpha=1~) acompetitiva \frac{K_m}{\alpha^{\prime}} \frac{V_{max}}{\alpha^{\prime}}
Ki = Ki' (\alpha = \alpha^{\prime}) não competitiva ~K_m~ \frac{V_{max}}{\alpha^{\prime}}
KiKi' (\alpha \neq \alpha^{\prime}) mista \frac{K_m\alpha}{\alpha^{\prime}} \frac{V_{max}}{\alpha^{\prime}}

Os ajustes por regressão não linear dos dados de cinética enzimática [32] podem proporcionar estimativas muito precisas das constantes de disociação Ki e Ki'.

Inibidores irreversíveis[editar | editar código-fonte]

Os inibidores enzimáticos também se podem unir e inactivar uma enzima de forma irreversível, geralmente por meio de modificações covalentes de resíduos do centro catalítico da enzima. Estas reacções decaem de forma exponencial e são habitualmente saturáveis. Abaixo dos níveis de saturação, mantêm uma cinética de primeira ordem em relação ao inibidor.

Mecanismos de catálise[editar | editar código-fonte]

A variação de energia como função de uma coordenada de reacção mostra a estabilização do estado de transição quando essa reacção é efectuada por uma enzima.

O modelo de ajuste induzido é o mais utilizado em estudos de interacção enzima-substrato.[33] Este modelo propõe que as interacções iniciais entre a enzima e o substrato são relativamente débeis, embora suficientes para produzir certas mudanças estruturais na enzima, que estabilizam e incrementam a força da interacção. Estas mudanças de forma implicam uma série de aminoácidos catalíticos do centro activo, nos quais se produzem as ligações químicas correspondentes entre a enzima e o substrato. Depois da união, um ou mais mecanismos de catálise diminuem a energia do estado de transição da reacção, por meio de uma via alternativa à reacção. Os mecanismos de catálise classificam-se com base em diferentes critérios: catálise covalente, catálise por proximidade e alinhamento de orbitais, catálise ácido-base geral, catálise por iões metálicos e catálise electrostática.

Os estudos de cinética enzimática não permitem obter o tipo de catálise utilizada por uma enzima. Alguns dados cinéticos podem proporcionar uma série de indícios que levem a realizar outro tipo de estudos dirigidos a determinar certo tipo de catálise. Por exemplo, um mecanismo de ping-pong na cinética do estado pré-estacionário poderá estar a sugerir uma catálise de tipo covalente. Por outro lado, variações no pH podem produzir efeitos drásticos em Vmax mas não em Km, o que poderia indicar que um resíduo do centro activo precisa um estado concreto de ionização para que se possa efectuar a catálise enzimática.

Notas[editar | editar código-fonte]

α. ^ Link: Interactive Michaelis–Menten kinetics tutorial (Java required)

β. ^ Link: dihydrofolate reductase mechanism (Gif)

γ. ^ Link: DNA polymerase mechanism (Gif)

δ. ^ Link: Chymotrypsin mechanism (Flash required)

Referências

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  2. Eisenthal R. Danson M.J. (Eds), Enzyme Assays: A Practical Approach. Oxford University Press (2002) ISBN 0-19-963820-9
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Leituras adicionais[editar | editar código-fonte]

  • Athel Cornish-Bowden, Fundamentals of Enzyme Kinetics. (3rd edition), Portland Press 2004, ISBN 1-85578-158-1.
  • Irwin H. Segel, Enzyme Kinetics : Behavior and Analysis of Rapid Equilibrium and Steady-State Enzyme Systems. Wiley-Interscience; New Ed edition 1993, ISBN 0-471-30309-7.
  • Alan Fersht, Structure and Mechanism in Protein Science : A Guide to Enzyme Catalysis and Protein Folding. W. H. Freeman, 1998. ISBN 0-7167-3268-8
  • Santiago Schnell, Philip K. Maini, A century of enzyme kinetics: Reliability of the KM and vmax estimates, Comments on Theoretical Biology 8, 169–187, 2004 DOI: 10.1080/08948550390206768
  • Chris Walsh, Enzymatic Reaction Mechanisms. W. H. Freeman and Company. 1979. ISBN 0-7167-0070-0
  • Nicholas Price, Lewis Stevens, Fundamentals of Enzymology, Oxford University Press, 1999. ISBN 0-19-850229-X
  • Tim Bugg, An Introduction to Enzyme and Coenzyme Chemistry Blackwell Publishing, 2004 ISBN 1-4051-1452-5

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