Evolução Sistemática de Ligantes por Enriquecimento Exponencial

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Evolução Sistemática de Ligantes por Enriquecimento Exponencial (SELEX - Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment, em inglês) também conhecido por seleção in vitro ou evolução in vitro, é uma técnica de combinação química na biologia molecular para a produção de oligonucleotídios de DNA ou RNA de cadeia única que se ligam especificamente com um ligante ou ligantes alvo.[1] [2] [3] Embora SELEX apareça como o nome mais usado geralmente para o procedimento, alguns pesquisadores têm referido ao procedimento como SAAB (área de ligação selecionada e amplificada) e CASTing (seleção e amplificação cíclica de alvos).[4] [5]

O processo começa com a síntese de uma enorme biblioteca de oligonucleotídios consistindo de sequências geradas aleatoriamente de comprimento fixo cercado por extremidades 5' e 3' que servem como iniciadores. Para uma região aleatória de comprimento n, o número de sequências possíveis na biblioteca é 4ⁿ (n posições com 4 possibilidades (A,T,C,G) em cada posição). As sequências na biblioteca são expostas para o ligante alvo - o qual pode ser uma proteína ou um pequeno componente orgânico - e aqueles que não se ligam ao alvo são removidos, normalmente por cromatografia de afinidade. As sequências ligadas são decantadas e amplificadas por RCP para serem preparadas para as etapas subsequentes da seleção, em que a rigidez das condições da decantação são aumentadas para identificar as sequências de mais ligações mais fortes. Um avanço no método original permite uma biblioteca de RNA omitir as regiões constantes de iniciadores, as quais podem ser difícil de remover após o processo de seleção porque elas estabilizam estruturas secundárias que são instáveis quando formadas por uma única região aleatória.[6]

A técnina tem sido utilizada para evolver aptâmeros de extrema afinidade de ligação com uma variedade de ligantes alvos, incluindo moléculas pequenas como o ATP[7] , a adenosina[8] [9] e proteínas como os príons[10] e VEGF (fator de cerscimento endotelial vascular)[11] . Usos clínicos da técnica são recomendados por aptâmetos que se ligam a marcadores de tumor[12] a um ligante-VEGF aptâmero, nomeado comercialmente de Macugen foi aprovado pela FDA para tratamento de degeneração macular.[13] [14]

Um cuidado avançado em relação com o método enfatiza que a seleção para ligações de afinidade extrema e sub-nanomolar podem de fato não beneficiar a especificidade para a molécula alvo.[15] Ligações fora do alvo relacionado com moléculas podem ter efeitos clínicos significantes.

Referências

  1. Oliphant AR, Brandl CJ & Struhl K (1989). Defining the sequence specificity of DNA-binding proteins by selecting binding sites from random-sequence oligonucleotides: analysis of yeast GCN4 proteins. Mol. Cell Biol.. 9:2944-2949.
  2. Tuerk C & Gold L (1990). Systematic evolution of ligands by exponential enrichment: RNA ligands to bacteriophage T4 DNA polymerase. Science. 249:505–510.
  3. Ellington AD & Szostak JW (1990). In vitro selection of RNA molecules that bind specific ligands. Nature. 346:818-822.
  4. Blackwell TK & Weintraub H (1990) Differences and similarities in DNA-binding preferences of MyoD and E2A protein complexes revealed by binding site selection. Science 250:1104-1110
  5. Wright WE, Binder M & Funk W (1991) Cyclic amplification and selection of targets (CASTing) for the myogenic consensus site. Mol. Cell Biol. 11:4104-4110.
  6. Jarosch F, Buchner K, Klussmann S. (2006). In vitro selection using a dual RNA library that allows primerless selection. Nucleic Acids Res 34(12):e86.
  7. Dieckmann T, Suzuki E, Nakamura GK, Feigon J. (1996). Solution structure of an ATP-binding RNA aptamer reveals a novel fold. RNA 2(7):628-40.
  8. Huizenga DE, Szostak JW. (1995). A DNA aptamer that binds adenosine and ATP. Biochemistry 34(2):656-65.
  9. Burke DH, Gold L. (1997). RNA aptamers to the adenosine moiety of S-adenosyl methionine: structural inferences from variations on a theme and the reproducibility of SELEX. Nucleic Acids Res 25(10):2020-4.
  10. Mercey R, Lantier I, Maurel MC, Grosclaude J, Lantier F, Marc D. (2006). Fast, reversible interaction of prion protein with RNA aptamers containing specific sequence patterns. Arch Virol 151(11):2197-214.
  11. Ulrich H, Trujillo CA, Nery AA, Alves JM, Majumder P, Resende RR, Martins AH. (2006). DNA and RNA aptamers: from tools for basic research towards therapeutic applications. Comb Chem High Throughput Screen 9(8):619-32.
  12. Ferreira CS, Matthews CS, Missailidis S. (2006) and GFP related fluorophores http://www.sciencemag.org/content/333/6042/642. DNA aptamers that bind to MUC1 tumour marker: design and characterization of MUC1-binding single-stranded DNA aptamers. Tumour Biol 27(6):289-301.
  13. Ulrich H, Trujillo CA, Nery AA, Alves JM, Majumder P, Resende RR, Martins AH. (2006). DNA and RNA aptamers: from tools for basic research towards therapeutic applications. Comb Chem High Throughput Screen 9(8):619-32.
  14. Vavvas D, D'Amico DJ. (2006). Pegaptanib (Macugen): treating neovascular age-related macular degeneration and current role in clinical practice. Ophthalmol Clin North Am. 19(3):353-60.
  15. Carothers JM, Oestreich SC, Szostak JW. (2006). Aptamers selected for higher-affinity binding are not more specific for the target ligand. J Am Chem Soc 128(24):7929-37.