Reação em cadeia da polimerase

Termociclador, Aparelho utilizado para realizar uma PCR

Reação em cadeia da polimerase (em inglês Polymerase Chain Reaction - PCR) é um método de amplificação (de criação de múltiplas cópias) de DNA (ácido desoxirribonucleico) sem o uso de um organismo vivo, por exemplo, Escherichia coli (bactéria) ou leveduras.^{Patente número 5656493}

Inventada em 1983 por Kary Mullis, a PCR é uma das técnicas mais comuns utilizadas em laboratórios de pesquisas médicas e biológicas para diversas tarefas, como o sequenciamento de genes e diagnóstico de doenças hereditárias, identificação de "impressão digital" genética (usado em testes de paterninade e na medicina forense), detecção de diagnóstico de doenças infecciosas e criação de organismos transgênicos.^{Saiki, R. K., D. H. Gelfand, S. Stoffel, S. J. Scharf, R. Higuchi, G. T. Horn, K. B. Mullis, e H. A. Erlich(1988)}

História

O processo de PCR foi descrito por Kary Mullis,em 1983, tendo-lhe sido posteriormente, em 1993, atribuído o Prémio Nobel da Química pelo seu trabalho. Em 1989, a Hoffman La Roche & Perkin-Elmer Corporation patenteou este processo. O método PCR é usado habitualmente nos laboratórios de investigação médica e biológica para uma variedade de tarefas, como a detecção de doenças hereditárias, que é a identificação de "impressões digitais" genéticas, a construção de árvores filogenéticas (árvores de relação entre espécies), a clonagem de genes (ver adiante), testes de paternidade, exames para detecção de agentes patogênicos e etc.

Aplicações

A PCR encontra sua principal aplicação em situações onde a quantidade de DNA disponível é reduzida. Em teoria, é possível amplificar qualquer DNA. Uma das principais aplicações da PCR é na medicina forense, onde pequenas amostras de DNA retiradas da cena de um crime (pedaços de cabelo que contenham bulbo, gotas de sangue ou saliva, pedaços de pêlo ou até mesmo a minúscula quantidade de DNA deixada em uma impressão digital) são amplificadas para serem analisadas pelo método de fingerprinting. O PCR também é rotineiramente utilizado em procedimentos científicos de Biologia Molecular como amplificação para gerar mutagênese, detecção de mutações ou preparação de fragmentos de DNA para clonagem (inserção em plasmídeo, por exemplo) como também pode ser utilizado para identificação de patógenos que estão presentes em amostras como por a exemplo identificação de agentes como Cândida sp, Chlamydia trachomatis, HPV Vírus do papiloma humano e seus genótipos, HIV Vírus da Hepatite B. etc A PCR também é utilizada na paleontologia para o sequenciamento gênico de animais pré-históricos. Também é muito utilizada na identificação de microrganismos, tendo em vista que apenas 1% dos microrganismos são cultivaveis e podendo ser isolados. A PCR é o primeiro passo para o posterior sequenciamento. Após obter as sequencias geradas pelos equipamentos pode-se consultar bases de dados na internet para tentar localizar suas possiveis origens, sendo bactérias, archeas ou etc.^{Elizabeth van Pelt-Verkuil, Alex van Belkum, John P. Hays}

Procedimentos

A Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) é um método muito sensível de análise e por isso é realizado com muito cuidado para evitar contaminações que possam inviabilizar ou tornar errôneo o resultado. O processo consiste basicamente em utilizar os mecanismos da replicação in vitro. Os cientistas então simplificaram ao máximo o processo de polimerização das moléculas. A maquinaria para separar as fitas sense e anti-sense são muito complexas na célula, no lugar utiliza-se a mudança de temperatura. Os ciclos são pensados para disponibilizar o sitio alvo para a ligação dos primers, funcionamento da polimerase e iniciou de um novo ciclo.^{Bruce A. White} Em primeiro lugar, deve-se extrair o material genético da célula ou outro material a ser estudado (exemplo: vestígios de crimes) sem danificá-lo. Normalmente o material extraído é o DNA (ADN), mas pode-se trabalhar com o RNA (ARN) em uma RT-PCR que é um desdobramento da PCR e possui outras aplicações.

Depois de extraído o DNA, a este é adicionada uma mistura (também conhecida como pré-mix) que contém os dNTPs (desoxirribonucleotídeos trifosfatos), que são as bases nitrogenadas ligadas com um três fosfato, os primers (também chamados de oligonucleotídeos ou iniciadores) e a enzima Taq-polimerase em uma solução tampão. Toda esta mistura é colocada no termociclador, o qual faz ciclos de temperatura pré-estabelecidos com tempos exatos específicos para cada reação (fragmento a ser amplificado).^{Ralph Rapley}

Na primeira etapa do ciclo a temperatura é elevada de 94 a 96 °C por pouco tempo para que haja a separação da dupla cadeia de DNA (Desnaturação, quebra das pontes de hidrogênio). Na segunda etapa, a temperatura é reduzida entre 50 a 60 °C dependendo da quantidade de citosina (C) e guanina (G) encontrada no primer, para que os primers se anelem (emparelham) com a fita molde de DNA (anelamento). Na última etapa do ciclo a temperatura é elevada a 72 °C para que a enzima possa funcionar sintetizando a nova molécula (extensão), em seguida um novo ciclo é iniciado. Normalmente são realizados de 25 a 40 ciclos para cada reação na qual a taxa de replicação é exponencial $2^{ciclos}$

O resultado é analisado através de uma eletroforese em gel de agarose ou de poliacrilamida e depois é interpretado com a ajuda de um profissional competente. Geralmente um padrão de peso molecular é adicionado em uma das fileiras do gel, assim poderá se avaliar o tamanho do fragmento amplificado

Variações da técnica basica de PCR

Nested PCR

Utilizado para aumentar a quantidade de produto amplificado final ou para aumentar a sensibilidade da técnica. Suas reações requerem dois pares de primers, um par mais externo para a 1^a reação (round) e outro interno ao produto do 1^a reação. A 1^a reação necessita de um maior tempo de extensão devido ao maior tamanho do produto a ser amplificado, em seguida adiciona-se uma alíquota da 1^a reação, que servirá de molde na mistura (mix) da 1^a reação. O produto da 1^a reação normalmente não é notado em corrida em gel de agarose, por outro lado o produto da 2^a reação gerado em grande quantidade, sim, por isso pode ser visualizado na corrida eletroforética ou utilizado para sequenciamento.^{School of Public Health University of California Eva Harris Faculty, Berkeley}

Hot Start

A reação de PCR é ativada quando a temperatura atinge 94⁰C. Esse procedimento aumenta a especificidade da PCR, pois a DNA polimerase contém um anticorpo, que se desnatura e ativa a enzima ao atingir a temperatura de 94⁰C. DNA polimerases que não possuem esse inibidor podem amplificar produtos indesejados (inespecíficos) em temperatura ambiente.

Galeria de imagens

Clonagem de um gene utilizando-se um plasmídeo.
Fingerprint genético: (1)Pai (2)Criança (3)Mãe. A criança somente possui genes (representados por traços pretos) herdados ou da mãe ou do pai.

Ver também

Bibliografia

↑ Saiki, R. K., D. H. Gelfand, S. Stoffel, S. J. Scharf, R. Higuchi, G. T. Horn, K. B. Mullis, e H. A. Erlich. Primer-Directed Enzymatic Amplification of DNA with a Thermostable DNA Polymerase. Science 239 (1988): 487-491. PubMed
↑ United States Patent 5,656,493 Mullis, et al. August 12, 1997: System for automated performance of the polymerase chain reaction, Patente Número - US 5656493
↑ Elizabeth van Pelt-Verkuil, Alex van Belkum, John P. Hays, Principles and Technical Aspects of PCR Amplification , Springer Science & Business Media, 2008 ISBN 1-402-06241-9 (em inglês)
↑ School of Public Health University of California Eva Harris Faculty, Berkeley, A Low-Cost Approach to PCR : Appropriate Transfer of Biomolecular Techniques: Appropriate Transfer of Biomolecular Techniques , Oxford University Press, 1998 , ISBN 0-198-02801-6 (em inglês)
↑ Bruce A. White, PCR Protocols: Current Methods and Applications, Springer Science & Business Media, 1993, ISBN 1-592-59502-2 (em inglês)
↑ Ralph Rapley, PCR Sequencing Protocols, Humana Press, 1996 ISBN 0-896-03344-9 (em inglês)

Ligações externas

Filme didático, sobre todo o protocolo desta técnica de biologia molecular (1).
Filme didático, sobre todo o protocolo desta técnica de biologia molecular (2).
Filme didático, sobre todo o protocolo desta técnica de biologia molecular (3).
Animação em Flash, Principio da PCR de forma prática e simples de visualizar (1).
Animação em Flash, Principio da PCR de forma prática e simples de visualizar (2).
Informação sobre todos os aspectos técnicos dos diferentes tipos de PCR.
Ciência Forense: exame de ADN - Prof. Emiliano Chemello