Cromatografia líquida de alta eficiência

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Cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE, em inglês: High performance liquid chromatography, HPLC) é um método de separação de compostos químicos em solução. Tem sido amplamente utilizada como ferramenta em várias áreas da química e biologia.

A cromatografia liquida foi definida no início de 1900 pelo botânico russo Mikhail S. Tswett. Considerado o pai da cromatografia, Tswett publicou o primeiro artigo de cromatografia líquida, no qual ele descreveu a separação de compostos (pigmentos de folhas) extraídos de plantas, utilizando solvente em uma coluna empacotada com partículas de carbonato de cálcio. No período entre 1906 e 1952 houve alguns avanços importantes, como por exemplo o surgimento da técnica de cromatografia planar, onde um papel é usado como suporte. No entanto, em 1950 foi introduzido como alternativa a camada fina de sílica, que posteriormente ficou conhecida como cromatografia de camada delgada (CCD). O avanço da cromatografia em coluna foi por volta de 1940, onde Martin e Synge, ganhadores do prêmio Nobel, descreveram a descoberta da cromatografia líquida-líquida (ou partição). Com o passar do tempo, a cromatografia líquida foi se aperfeiçoando até chegar no que conhecemos hoje como cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE) (JANDERA; HENZE, 2012; MILLER, 2005).

Princípios gerais da cromatografia[editar | editar código-fonte]

O princípio básico da cromatografia é a separação de misturas, no qual os componentes a serem separados são distribuídos entre duas fases, uma fase estacionária e uma fase móvel, como mostrado na figura 1.

Figura 1: Esquema simplificado de separação de duas misturas.

Entre os diferentes tipos de cromatografia, a cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE, em inglês: High performance liquid chromatography, HPLC) tem sido amplamente utilizada como uma ferramenta na bioquímica e análise de separação, identificação e quantificação de compostos ativos (HAYES et al., 2014). Um esquema simplificado de CLAE está descrito na figura 2.

Figura 2: Esquema de um HPLC: a) Reservatório da fase móvel; b) Desgaseificador; c) Bomba; d) Injetor de amostra; e) Compartimento de colunas termostatizado; f) Coluna de separação; g) Detector; h) Processador de dados.

Os principais componentes da cromatografia líquida são: a bomba, que movimenta a fase móvel e a amostra através da coluna; uma coluna, que contêm a fase estacionária, geralmente formada por partículas de sílica, porosas, esféricas e diâmetro em torno de 35 μm, e um detector que mostra os tempos de retenção das moléculas, sendo que o tempo de retenção varia de acordo com as interações da amostra com as fases estacionária e móvel (MALVIYA et al., 2010).

Parâmetros cromatográficos[editar | editar código-fonte]

Tempo de retenção[editar | editar código-fonte]

O tempo de retenção (tR) é o tempo gasto por um componente desde a sua injeção até a sua detecção na saída do sistema. O tempo de retenção engloba todo o tempo que um componente fica no sistema cromatográfico, seja diluído na fase móvel, seja retido na fase estacionária. A Figura 3 ilustra um cromatograma típico. O tempo indicado no primeiro sinal do cromatograma indica o tempo gasto pelas moléculas da fase móvel para atravessar a coluna e atingir o detector. Esse tempo é chamado de tempo morto (tM), e normalmente é determinado por algum composto ou impureza presente na mistura em análise que não é retido pela fase estacionária. Para a determinação dos tempos de retenção corrigidos (t’R) é necessário conhecer o tempo morto, uma vez que a correção é feita simplesmente descontando o seu valor do valor do tempo de retenção (MEYER, 2010).

Figura 3: Cromatograma típico para cálculo de parâmetros cromatográficos.

Fator de retenção ou capacidade[editar | editar código-fonte]

O fator de retenção é a medida da capacidade da coluna em reter um componente da amostra, ou seja, é a medida de retenção na fase estacionária (MILLER, 2005). O fator de retenção é dada pela equação abaixo:

Form1.png

onde,

k= fator de capacidade

tR = tempo de retenção

tM = tempo morto

Coeficiente de separação ou seletividade[editar | editar código-fonte]

O coeficiente de separação (a) é calculado pela razão entre os fatores de capacidade (k’) de dois compostos que resultem em picos adjacentes no cromatograma (MILLER, 2005). Por definição a seletividade é sempre maior que 1, e pode ser calculada pela equação abaixo:

Fator de retenção.png

onde,

a = fator de capacidade

k’B = fator de capacidade do composto B

k’A = fator de capacidade do composto A

trB = tempo de retenção do composto B

trA = tempo de retenção do composto A

tm = tempo morto

Eficiência[editar | editar código-fonte]

Para estimar a eficiência de uma coluna cromatográfica podemos usar dois termos que estão relacionados entre si: o número de pratos teóricos (N) e a altura equivalente a um prato teórico (H ou HETP), que se relacionam pela equação a seguir:

Eficiência.png

onde,

L = o comprimento da coluna cromatográfica

            A altura equivalente de um prato teórico é utilizada para comparar a eficiência entre colunas de diferentes comprimentos. Quanto menor a altura do prato teórico, maior será a eficiência da coluna (MEYER, 2010).                                                                                                                                                                                   

Resolução[editar | editar código-fonte]

Para determinar a resolução entre duas bandas, consideram-se as larguras das bandas assim como seus respectivos tempos de retenção, de acordo com a equação a seguir:

Resolução.png

Embora os parâmetros de citados acima sejam importantes, a separação de substâncias não depende somente deles. O alargamento das bandas, assim como a eficiência e a seletividade influenciam em uma boa resolução. Pode-se resumir a resolução como um relação complexa entre a eficiência (N), seletividade (α) e a retenção (k) (MEYER, 2010):

Resolução 2.png

Alargamento de banda[editar | editar código-fonte]

Uma baixa eficiência de separação pode ser explicada pelo alargamento da banda de um composto. Há muitas razões que contribuem para o alargamento da banda, os fatores intrínsecos podem ser explicados pela equação de Van Deemter.

Van Deemter.png

onde,

A = difusão por turbilhonamento (difusão de eddy)

B = difusão longitudinal

C = desequilíbrio local ou resistência à transferência de massa

A equação de Van Deemter é a equação fundamental para a descrição da performance de uma coluna, e mostra a relação da altura equivalente de um prato teórico, com a velocidade da fase móvel, u.

                                                A difusão por turbilhonamento (A) é consequência dos diversos caminhos que as moléculas da amostra podem percorrer através da coluna. A difusão de três moléculas são mostradas na figura 4. Todas as três começam na mesma posição inicial, mas elas tendem a seguir caminhos diferentes ao longo da coluna empacotada. Devido ao fluxo constante da fase móvel, as três moléculas chegam com tempos diferentes e consequentemente se separando. A molécula que pegou o caminho direto (molécula 3) termina na parte da frente da banda, por exemplo. Esse termo da equação pode ser minimizado usando-se colunas de tamanho reduzido, com diâmetros internos menores, com enchimentos eficientes e partículas uniformes.                       

Figura 4: Ilustração da difusão de eddy ou efeito dos caminhos múltiplos.

                                                                       

O termo B, difusão longitudinal, se refere a difusão do soluto na fase móvel. Se a amostra permanece por um determinado período dentro da coluna, ela tenderá a se difundir em todas as direções (é como se fosse um cubo de açúcar dissolvendo no café sem agitar) (figura 5). Uma forma de minimizar este efeito é empregando-se altas velocidades lineares de fase móvel.

Figura 5: Alargamento da banda por difusão longitudinal

A resistência à transferência de massa, termo C, se refere ao processo de movimentação da amostra dentro e fora da fase estacionária e da fase móvel. Conforme a transferência de massas for mais rápida, melhor é a eficiência. Este processo pode ser melhorado pelo uso de camada mais finas de fase estacionárias, partículas menores, fases móveis de baixa viscosidade, assim como altas temperaturas (MILLER, 2005; MEYER, 2010).

Detectores de HPLC[editar | editar código-fonte]

O detector cromatográfico é um dispositivo conectado logo após a coluna cromatográfica que quando em contato com os analitos presentes no eluente, emite sinais elétricos que são registrados na forma de picos. Através deste registro, podem-se obter dados qualitativos e quantitativos sobre os analitos presentes na amostra.

 Existem vários tipos de detectores, sendo que a escolha dependerá fortemente das características químicas ou físicas das espécies a se detectar. Os detectores de HPLC devem possuir várias características, entre elas:

Alta sensibilidade, seletividade, linearidade (correspondente a aumento da concentração do analito), pouco sensível às variações de temperatura e fluxo, preciso e com reprodutibilidade.  Assim, o detector ideal é aquele adequado ao seu sistema cromatográfico, a fase móvel (eluente) utilizada e principalmente as propriedades dos analitos alvos presentes na análise.

O primeiro detector considerado na cromatografia líquida foi o olho humano, que através dos experimentos clássicos utilizando uma coluna de vidro, permitiu-se separar os compostos de colorações diferentes.  Os primeiros detectores comerciais utilizados em um sistema de HPLC foram os detectores de índice de refração e de condutividade, entretanto, com a introdução do detector de UV em técnicas de HPLC, ampliaram-se as possibilidades de uso da cromatografia líquida na química analítica.  

Detectores de UV-visível[editar | editar código-fonte]

São os detectores mais utilizados em HPLC, pois apresentam o mais baixo custo, aceitam o uso de gradiente e geralmente não são afetados por pequenas mudanças de fluxo e temperatura. Ele consiste em um fotômetro que mede a absorção de luz dos compostos, em certo comprimento de onda, compreendido entre as regiões visível e ultravioleta.

O princípio da detecção por UV-vis pode ser definido através da concentração do analito relacionada à fração da luz transmitida pela célula do detector pela lei de Beer-Lambert, onde:

A = Log (I0 / I ) = b.c. ε

Onde:

A - Absorbância ;

I0 - Intensidade da incidência de luz;

ε - Absortividade molar da substância;

b -Comprimento do percurso da célula do detector (cm) ;

c- Concentração da amostra em mols/L.

A absorvidade molar para um grande número de compostos pode ser encontrado na literatura. A absorbância geralmente é proporcional à concentração da amostra.

A configuração de um detector de UV-vis de comprimento de onda fixo  pode ser representada pela seguinte figura 1:

figura 1 - detector de UV-vis de comprimento de onda fixo  

A lâmpada, também chamada de fonte luminosa, pode ser de tungstênio, deutério, mercúrio, zinco, cádmio, xenônio ou outros, que será aplicada de acordo com a configuração do detector e comprimento de onda desejado.

As configurações mais comuns dos detectores de UV-vis são: Detector de comprimento de onda fixo, detector de comprimento de onda variável e detector de rede de diodos (diode array).  Este último permite determinar os espectros das substâncias presentes da amostra no eluente com diferentes comprimentos de onda durante a análise cromatográfica.

A detecção por UV-vis é geralmente aplicada em compostos cujas moléculas possuam algumas características para a absorção na região de UV-vis. Abaixo segue tabela com os grupos principais que compõe os analitos analisados:  

Tabela 1 - PRINCIPAIS GRUPOS QUE ABSORVEM NA REGIÃO DE UV-Vis
Ligação dupla adjacente a um átomo com um par de elétrons livres
Bromo, iodo ou enxofre
Grupo carbonila (C=O  )
Grupo nitro ( NO2  )
Duas ligações duplas conjugadas
Anel aromático
Íons inorgânicos: Brometo,iodeto, nitrito, nitrato
A intensidade da absorção da molécula dependerá dos grupos presentes e da influência que eles podem exercer sobre os outros grupos presentes. 

Detector de Fluorescência[editar | editar código-fonte]

São sensíveis, seletivos e com alta especificidade entre os detectores de HPLC. A sensibilidade deste tipo de detector pode ser de 10 a 1000 vezes mais que os detectores de UV-vis.  O funcionamento do detector de fluorescência consiste em uma lâmpada de excitação  (de espectro de bandas ou contínuo) seguida por um filtro  ou uma rede de difração, incidindo o feixe luminoso sobre a célula da amostra e excitando a mesma, originando a emissão de um feixe de luz ao retornar ao estado fundamental, o qual é em seguida dirigido a um filtro ou monocromador, que seleciona o comprimento de onda emitido, fazendo-o incidir no  fotodetector. Aplica-se em análises de HPAs, aminoácidos, esteroides, vitaminas e aditivos, corantes alimentares.

Detector de índice de refração (RI - Refrative index)[editar | editar código-fonte]

Também chamado de refratômetro diferencial, é conhecido como detector universal por apresentarem resposta para qualquer espécie de amostra. A análise baseia-se na mudança do índice de refração do eluente por causa dos componentes da amostra. Quanto maior a diferença do índice de refração da fase móvel e o componente da amostra, mais intenso é o sinal. Há três tipos de sistema óptico utilizados nos detectores de índice de refração: Fresnel, Deflexão e interferômetro.

 A figura 2 demostra a configuração típica de um detector de índice de refração.

figura 2 -configuração típica de um detector de índice de refração

Este detector possui as seguintes características:

 - Versatilidade, pois detecta todos os solutos;

-Moderada sensibilidade, sendo o detector de UV 1000vezes mais sensíveis, assim não recomendável para análise de traços;

-Sensível a qualquer alteração de temperatura alterando a resposta do detector.

 -Fácil de operar;

- Pouco recomendável realizar gradiente;

- Não é destrutivo.

Os detectores de índice de refração são empregados quando outros disponíveis não correspondem aos compostos de interesse e a sensibilidade não for muito importante, em separações preparativas e nas análises de macromoléculas em cromatografia de exclusão por tamanho.

Detector eletroquímico (amperométrico)[editar | editar código-fonte]

A detecção é feita através da oxidação ou redução de compostos em célula de fluxo a partir dos eletrodos de trabalho e de referência na presença de um potencial elétrico. Pode apresentar um limite de detecção extremamente baixo e muito utilizado em análises de traços de compostos orgânicos com grande seletividade.

Detector condutimétrico[editar | editar código-fonte]

Aplicado em cromatografia Iônica, estes detectores tem alta sensibilidade e seletividade.  A medição é realizada através da medida da condutividade total (eluente e componentes da amostra) com uma célula contendo entre dois a seis eletrodos de Ag, Pt ou aço inoxidável. Em alguns métodos, pode ser necessário o supressor, um artificio utilizado para reduzir os interferentes da fase móvel na medição. O detector condutimétrico é utilizado principalmente para determinação de cátions, ânions, metais, sulfactantes e ácidos orgânicos.

Espectrômetro de massas[editar | editar código-fonte]

Introduzido inicialmente em sistemas de HPLC com métodos bioanalíticos na determinação de fármacos em plasma e urina, os detectores de espectrômetro de massa para HPLC são muito utilizados em pesquisas e desenvolvimento permitindo a informação estrutural de compostos e a identificação de componentes desconhecidos presentes em amostras através da determinação de massa, carga  e estrutura proveniente da forma ionizada dos componentes . Possui alta sensibilidade e aplicável a diversos analitos. O avanço nas formas de nebulização para vaporização da amostra, minimizando os efeitos do eluente, permitiu uma ampla aplicação do espectrômetro de massas na cromatografia líquida, antes mais restrita a detecção por cromatografia gasosa para análise de compostos voláteis.

  Os sistemas de HPLC-MS e HPLC- MS/ MS dispõe de dispositivos acoplados ao sistema para viabilizar a vaporização do eluente + compostos para pesquisa dos espectros/massa. Os mais comuns são ionização eletronebulização (ESI- electrospray ionization) e ionização química em pressão atmosférica (APCI - atmospheric pressure chemical ionization).

Além dos detectores citados, há muitos outros detectores para HPLC com diversas aplicações, específicos ou não, entre eles:

- Detectores de radiotividade;

- Detectores de quimioluminescência de nitrogênio;

- Detectores quirais;

- Detectores de espalhamento de luz (light-scattering).

Bombas[editar | editar código-fonte]

A bomba é sem dúvida um dos mecanismos mais importantes para o sistema de cromatografia liquida, sem ela não é possível movimentar o solvente e os analitos pelo sistema da coluna até o detector. Um mecanismo de bomba de fluido funciona de maneira a fornecer um fluxo uniforme de para o sistema, devendo ser de forma constante, uniforme e na pressão mais adequada para cada situação e característica de equipamento. Essas características garantem a qualidade, rapidez e eficiência da analise a ser realizada. Além disso precisam ter resistência e ao mesmo tempo devem ser capazes de proporcionar características de fluxo reprodutíveis corrida após corrida. Em operações normais nas análises de HPLC, a pressão analítica pode variar entre 2000 e 5000 psi, mas em aplicações em UHPLC pode variar entre 15000 e 18000 psi (SNYDER. 2000).

O tipo mais comum de bomba utiliza uma câmara com um pistão no seu interior e são de longe, as mais utilizadas em praticamente 100% dos equipamentos comerciais de HPLC. O pistão tem ciclos que enchem e esvaziam a câmara em conjunto da ação de mecanismos de válvula localizados na entrada e na saída da câmara. O movimento causa reciprocidade do êmbolo no interior da câmara transportando o solvente por meio de um movimento alternado de um êmbolo numa câmara hidráulica. No curso de retorno o solvente é aspirado e é empurrado à coluna no curso de avanço. As taxas de fluxo podem ser definidas ajustando o volume deslocado em cada curso. Pistões duplos e triplos consistem em unidades idênticas e que operam a altas pressões e evitam a variação da pressão de acordo com a fase do ciclo, enquanto um pistão estiver em um ciclo de enchimento o outro está no ciclo de esvaziamento. O que garante uma alta pressão e torna possível manter a taxa de fluxo constante. No entanto é necessário um sistema de amortecimento para posterior eliminação de impulsos de pressão. Para produzir bons cromatogramas, é desejável ter uma taxa de bombeamento de fluxo tão constante quanto possível. (SNYDER; ASHRAF-KHORASSANI. 1995)

As linhas de entrada e de saída são ligadas à câmara do pistão. Existem duas válvulas de retenção ligadas à parte mais superior da bomba uma na linha de entrada e outra na linha de saída, sendo elas de mecanismo operado por esfera. A válvula permite o fluxo de entrada a partir da linha de entrada para a câmara do pistão, mas não no sentido inverso. A válvula de saída permite que o fluxo a partir da câmara para a linha de saída, mas não no sentido inverso. O motor move repetidamente o pistão pelo curso da câmara, em fases de expansão e compressão. Quando o pistão se move para fora, é criado um vácuo, é criada baixa pressão na câmara que faz com que o líquido entre e encha a câmara através da válvula de retenção de entrada, mas maior pressão na saída faz com que a válvula de saída se feche. Em seguida, quando o pistão se move para dentro, que pressuriza o líquido dentro da câmara a alta pressão na câmara faz com que a válvula de entrada se feche e obriga a válvula de saída a abrir, empurrando o líquido para fora na linha de saída. Estes cursos de sucção e descarga alternadas são repetidos constantemente para movimentar o liquido (SNYDER, 2000. MENDICHI, 1998).

Para garantir resistência ao desgaste mecânico e resistência química a solventes os pistões são feitos de safira artificial e as válvulas de retenção são de rubi para as esferas e safira para a sede das válvulas.

Uma bomba ideal deve ter as seguintes características:

  • Compatibilidade com o solvente e resistência à corrosão
  • Fluxo constante e independente da pressão de retorno
  • Facilidade na substituição de peças desgastadas
  • Baixo volume morto para evitar ou minimizar os problemas quando é trocado o solvente

Colunas[editar | editar código-fonte]

A coluna é um componente chave para o funcionamento de um Cromatógrafo Líquido de Alta Eficiência. A Eficácia de uma análise cromatográfica depende, fundamentalmente, da coluna selecionada conforme a natureza das substâncias a serem determinadas.

Tipos de Colunas[editar | editar código-fonte]

Em um CLAE podem ser utilizados três tipos de coluna: coluna de saturação, ou pré-coluna, coluna guarda e a coluna de separação.

a)      A coluna de saturação ou pré-coluna é colocada entre a bomba e o injetor e é empregada para condicionar a fase móvel (FM). A utilização de uma coluna de saturação visa a proteção da fase estacionária (FE) da coluna de separação. A FM, estando saturada ao entrar na coluna de separação, não ataca a FE aumentando seu tempo de uso.

b)      A coluna de guarda é colocada entre o injetor e a coluna de separação e tem a finalidade de proteger a coluna de separação, aumentando o seu tempo de uso. Deve ser recheada com a mesma FE ou uma similar à coluna de separação.

c)      A coluna de separação é parte fundamental da CLAE sendo responsável pela separação dos componentes presentes na amostra analisada. A coluna de separação é importante a ponto de o sucesso da análise depender da escolha adequada da coluna de separação.

As colunas utilizadas na CLAE geralmente possuem diâmetro variando de 02 a 21 mm. As colunas de 2 mm são mais comumente empregadas em CLAE de pressão ultraelevada (também chamados de UHPLC), as colunas de 4-6 mm são empregadas na grande maioria das aplicações de CLAE e as colunas com diâmetro em torno de 21 mm são utilizadas na CLAE semi-preparativa.

Os tubos utilizados costumeiramente são de aço inox, sendo mais resistentes às altas pressões presentes na CLAE e mais inertes às possíveis oxidações químicas resultantes do meio. Os tubos de cobre são evitados pela possibilidade de absorver ou reagir com alguns compostos ou fases móveis, especialmente as ácidas. Os comprimentos das colunas podem variar de 10-13 cm ou de 25-30 cm (CIENFUEGOS, 2000).

Existe, ainda, a possibilidade de utilização de colunas feitas com vidro de paredes grossas, que apresentam o inconveniente de não terem conexão adequada entre o vidro e o metal que resistam às altas pressões, sem vazamento. A sílica fundida também tem sido utilizada na confecção de colunas capilares por ter força mecânica extremamente alta, o que permite o uso de altas pressões, ótima transparência na região de UV e de fluorescência e boa flexibilidade, facilitando a conexão coluna-injetor e coluna-detector (COLLINs et al, 2006).

A escolha da coluna é feita em função da sua capacidade, que pode ser determinada por suas dimensões, comprimento e diâmetro interno e pelo material de recheio. A seguir será apresentada uma tabela de classificação das colunas de separação em função dos parâmetros dimensionais.

Tabela - Classificação das colunas de separação (COLLINS et al, 2006).
Nome Comprimento (cm) Diâmetro interno (mm) Vazão (µL min-1) Tamanho de partícula (µm)
Colunas rápidas 3-10 2-6 1.000-5.000 3
Convencional ou analítica 5-30 2-6 1.000-3.000 3;5;10
Small

bore ou microbore

10-100 1-2 5-200 1;3;5
Capilar recheada 20-200 0,1-0,5 0,1-20 1;3
Capilar semipermeável 100-10.000 0,02-0,1 0,1-2 1;3
Capilar aberto ou tubo aberto 100-10.000 0,01-0,075 0,05-2 *
Preparativa ≥ 20 ≥ 10 ≥ 1.000 ≥ 10

* filme líquido ligado nas paredes  

 Enchimento das Colunas (recheio da coluna) 

 O material mais utilizado como base para as colunas cromatográficas é a sílica. Algumas propriedades justificam sua utilização, como a pureza, ausência de íons metálicos; formato das partículas, esférico ou irregular; tamanho das partículas; e distribuição do tamanho das partículas.

O tamanho da partícula tem relação direta com a eficiência da coluna na CLAE. Quanto menores as partículas do recheio da coluna, maior a pressão da coluna no sistema. Da mesma forma, quanto menores as partículas do recheio da coluna, mais finos serão os picos e melhor será a separação. A figura apresentada a seguir demonstra a relação do tamanho da partícula utilizada no recheio da coluna com a eficiência cromatográfica (H – altura equivalente do prato teórico) (LAKE, 2015). A figura relaciona H com a velocidade linear do fluxo cromatográfico em diferentes diâmetros de partícula, havendo menor dependência de H vs u para partículas menores.

Além da redução do tamanho das partículas de enchimento a redução do diâmetro interno da coluna também aumenta a eficiência do sistema. Devido a essa tendência recentemente tem sido desenvolvidas colunas com diâmetros cada vez mais reduzidos, surgindo as nanocolunas, que tem gerado uma nova designação para a CLAE, "Nano LC". As colunas comumente utilizadas nessa categoria nano têm diâmetro interno em torno de 75µm. As colunas de Nano LC requerem fluxos muito baixos (em torno de 500nL/min), tempos de análise elevados, separação de amostras bastante complexas e ganho de sensibilidade.

Figura 6: Eficiência cromatográfica em função do tamanho da partícula (LAKE, 2015).

Cuidados Especiais com as Colunas[editar | editar código-fonte]

Alguns cuidados devem ser tomados no uso, manutenção e armazenamento de uma coluna cromatográfica a fim de aumentar sua vida útil e melhorar alguns parâmetros como, reprodutibilidade do tempo de retenção, resolução, tempo de estabilização, dentre outros (CIENFUEGOS, 2000).

1)      Utilização de pré-coluna;

2)      Limpeza da coluna: realizar periodicamente, a fim de restaurar ou ativar a fase estacionária.

3)      Uso: controlar histórico com registros contendo as datas de utilização e as soluções e analitos analisados.

4)      Guardar a coluna: quando não instalada a coluna deve ser guardada adequadamente, em sua embalagem de origem e com as extremidades vedadas com as tampas de proteção para evitar perda de sua fase móvel ou contaminações;

5)      Sentido: deve-se ter um cuidado especial para que não seja invertido o sentido de injeção realizado em sua primeira utilização;

6)      Choques: as colunas não devem sofrer choques mecânicos para evitar desestabilização das fases estacionária e móvel no seu interior;

7)      Filtração e pureza da fase móvel: deve-se utilizar soluções rigorosamente filtradas para não prejudicar a eficiência da coluna. Os solventes utilizados devem ter pureza cromatográfica;

8)      pH: respeitar as faixas de pH recomendadas pelo fabricante da coluna. Evitar faixas extremas de pH, < 2 ou > 8;

9)      Precipitações: evitar precipitações avaliando as características das amostras a serem analisadas e escolher fase móvel adequada para que não ocorra problemas de precipitação.

Cromatografia de adsorção[editar | editar código-fonte]

A cromatografia de adsorção pode ser comparada aos raios de luz em um espectro, em que se separam os diversos componentes de uma mistura de pigmentos, podendo então ser determinados qualitativa e quantitativamente.

                Se possuirmos uma amostra que contenha limalha de ferro e areia, poderemos facilmente separá-la usando um imã. Também não há problemas em separar acetona (p.e. 58 ºC) da água (p.e. 100 ºC) por destilação fracionada. Por outro lado, é muito difícil separar os componentes do ar líquido por destilação fracionada, porque o oxigênio líquido tem ponto de ebulição de -183 ºC e o nitogênio líquido de -196ºC. Os pontos de ebulição dos gases nobres estão muito próximos a esses valores.

                Em química e biologia, muitas vezes é necessário separar, purificar e identificar os componentes de misturas muito mais complexas do que as citadas anteriormente. Por exemplo, a identificação dos componentes individuais de uma mistura de aminoácidos de uma proteína é quase impossível por um método como a cristalização fracionada, devido às semelhanças nas propriedades físicas e químicas dos componentes. Já por meio de cromatografia, é possível obter uma excelente separação.

                Praticamente não há campo da química e da biologia em que não se use a cromatografia de alguma forma. A análise por cromatografia de papel é usada em medicina (na detecção de venenos), em exames de tecidos biológicos e seus processos químicos relacionados e nos estudos estruturais de moléculas complexas, tais como hidratos de carbono, proteínas e fenóis complexos de plantas. A cromatografia é tão importante na química orgânica como na química inorgânica. Foi o método empregado para a separação dos produtos obtidos na fissão nuclear antes do desenvolvimento das resinas de intercâmbio iônico.

                A cromatografia de adsorção é um procedimento no qual uma solução de substâncias a separar se desloca numa direção predeterminada por uma disposição de aparatos, por meio de uma fase sólida, insolúvel, inorgânica ou orgânica, sendo os componentes retidos em medida individualmente distinta. Em geral, na cromatografia de adsorção empregam-se como adsorventes óxidos, óxidos hidratados ou sais.

                A mistura de substâncias atravessa a fase sólida, finamente dividida, sendo que cada componente da mistura percorre uma distância por ser menos ou mais retido na superfície do sólido. A escolha do dissolvente baseia-se, em geral, no fato de que as substâncias em questão podem eluir-se bem com os mesmos solventes ou misturas de solventes que as dissolvem bem. Se o dissolvente e o soluto movem-se ao mesmo tempo, pode-se expressar a relação entre as distâncias percorridas por cada um através da fórmula:               

                RfDistância percorrida pelo soluto

            Distância percorrida pelo eluente            

Cromatografia de Exclusão por Tamanho (exclusão molecular)[editar | editar código-fonte]

Dentre todos os métodos cromatográficos a Cromatografia de Exclusão por Tamanho (do Inglês Size Exclusion Chromatography) foi a última a ser desenvolvida. A nomenclatura recomendada em português para esse método é cromatograia de exclusão molecular. O primeiro trabalho foi publicado por Plodin em 1959, que utilizou esta técnica para separação de biopolímeros. Para a separação de biomoléculas no sistema aquoso, a cromatografia por exclusão é nomeada de cromatografia de filtração em gel, enquanto a separação de polímeros orgânicos em sistemas não aquosos é chamada de cromatografia de permeação em gel. Para que haja separação é necessário que as massas moleculares dos analitos tenham uma diferença de pelo menos 10%.

O método de separação na Cromatografia de Exclusão por Tamanho, diferentemente das técnicas de cromatografia iônica e por partição (fase normal e fase reversa), não envolve processos químicos nem físicos, somente mecânico. É baseada no efeito de peneiração molecular e torna possível a separação de moléculas de acordo com seus tamanhos. A coluna contém um recheio com poros de vários tamanhos, e o eluente se encontra dentro dos poros e também se movendo através da coluna. Os canais entre as partículas são muito maiores que seus poros. As moléculas de analitos maiores que todos os poros, não penetram em nenhum destes, e são eluídas no volume de exclusão da coluna (vo). As moléculas de analitos menores que todos os poros, durante a eluição, entram em todos os poros, e só são eluídas no limite de permeação da coluna (vt). As moléculas de analitos com massas moleculares intermediárias entram em alguns poros e em outros não. A Figura 6 mostra uma ilustração do processo de separação.

Figura 6: Mecanismo de separação em uma coluna de cromatografia de exclusão por tamanho

A resolução é baseada no tamanho efetivo das moléculas dos componentes da amostra em solução. E existem limites que determinam o intervalo de tamanhos. O primeiro é o inferior, chamado de limite de permeação, abaixo do qual todas as moléculas de menor tamanho são igualmente difundidas dentro dos poros do material e o segundo é o superior, chamado limite de exclusão, acima do qual todas as moléculas são muito grandes para penetrar nos poros. Moléculas de tamanho intermediário entre ambos os limites serão separadas totalmente ou parcialmente de acordo com a seletividade característica de cada molécula. Então, serão eluídas sem resolução as moléculas menores que o limite de permeação e as maiores do que o limite de exclusão, separando somente as que se encontram dentro destes limites. Desta forma, esta técnica não possui muitos parâmetros a serem ajustados, já que esta não depende do eluente. O eluente só serve para levar as moléculas e evitar interações da amostra com a fase estacionária; não tem a mesma seletividade que em outras técnicas de cromatografia. Para aumentar a resolução deve-se utilizar duas colunas ligadas uma a outra ou aumentar o tamanho da coluna. Em geral, se obtém picos finos, pois a dispersão é baixa e todos os componentes da amostra devem sair entre vo e vt .

O tamanho pode ser estimado de acordo com o tempo que a substância permanece nos poros. O tempo de retenção observado é sempre inversamente proporcional à massa molecular do analito. As moléculas menores, capazes de entrar nos poros menores da coluna, terão tempos de retenção mais longos; moléculas maiores, que são parcialmente ou completamente excluídas, terão os tempos de retenção menores Figura 7.

Figura 7: Cromatograma obtido a partir de uma cromatografia de exclusão por tamanho

As matrizes utilizadas são de sílica ou polímeros orgânicos com um maior ou menor grau de entrecruzamento, formando poros de diferentes tamanhos. São hidrofílicas, e assim capazes de absorver água, o que causa a abertura de sua estrutura porosa. As matrizes a base de sílica são mais rígidas, suportam altas temperaturas e alta pressão. Mas, quando se trabalha a níveis de nanogramas, significantes efeitos silanofílicos ocorrem, incluindo a perda do metal na presença de eluentes de baixa força iônica. Já com a matriz a base de polímeros a perda de metal é negligenciável. Durante o processo de fabricação das matrizes, o tamanho e a distribuição das partículas devem ser controlados; partículas menores resultam numa melhor resolução e eficiência, porém, pode haver resistência ao fluxo. Em geral, o tamanho das partículas varia de 5 a 17 µm.

Para a calibração da Cromatografia de Exclusão por Tamanho são utilizados padrões denominados marcadores de massa molecular, que devem possuir massas moleculares diferentes entre si, para que haja separação. Além disso, é desejável que as massas moleculares dos marcadores sejam semelhantes às massas dos analitos. A curva de calibração pode ser construída a partir dos volumes ou tempos de eluição versus massa molecular ou a partir da constante de distribuição (Kav) versus logaritmo das massas moleculares (Da). O uso do segundo método de calibração é necessário quando o objetivo é determinar a faixa de massa molecular das espécies com massas elevadas ou muito próximas. A constante de distribuição do analito no sistema eluente resina, pode variar de 0 até 1, que correspondem a exclusão e permeação totais da coluna; e é calculada pela fórmula:

                                            Kav = ve – v0/vt – v0
          ve = volume de eluição
          v0 = volume de exclusão da coluna
          vt = volume de permeação total

Se o valor de Kav for maior que 1 quer dizer que estão ocorrendo fenômenos além da exclusão por tamanho, como adsorção ou partição. Através da curva de calibração é possível a determinação das massas moleculares de componentes de uma amostra desconhecida, como é mostrado na Figura 8.

Figura 8: Curva padrão para uma cromatografia de exclusão por tamanho. Modificado de MEYER, V. R.

Outro mecanismo proposto é o Mecanismo Secundário de Exclusão. Este mecanismo ocorre quando uma amostra contém uma mistura de moléculas pequenas e grandes é aplicada a uma coluna, as moléculas pequenas difundem-se rapidamente dentro dos poros, enquanto que as moléculas grandes encontrarão poucos poros desocupados e irão avançar ainda mais na coluna até encontrar poros desocupados. Isto resulta no melhoramento da separação de pequenas e grandes moléculas.

A Cromatografia de Exclusão por Tamanho pode ser aplicada para separação de compostos com alta massa molecular como polímeros, proteínas e aminoácidos. Além disso, é bastante útil em processos de purificação e dessalinização, em estudos de ligações proteína-ligante e de enovelamento de proteínas, para concentração de amostra, estudos de copolimerização e determinação da massa molecular relativa.

Cromatografia Preparativa[editar | editar código-fonte]

A técnica de cromatografia líquida de alta eficiência é comumente utilizada para identificar e quantificar substâncias. Como ocorre a separação é possível à alteração do sistema e suas escalas para que seja possível a coletar ao final da corrida cromatográfica, amostras em quantidades suficientes para análises posteriores tornando assim um sistema de purificação de amostra.

A cromatografia líquida preparativa é utilizada para o isolamento e purificação produtos químicos e farmacêuticos assim como na área de biotecnologia e bioquímica. Dependendo da área de trabalho a quantidade de composto para isolado muda drasticamente entre ug ate mg como no isolamento de enzimas em biotecnologia, neste escala de micro purificação, e para identificação e elucidação de estrutura de compostos desconhecidos com na síntese de produtos naturais, é necessário obter compostos puros em quantidades que variam de um ou mais miligramas.

 Para realizar a cromatografia preparativa é necessária a utilização de equipamento cromatográfico que comporte uma grande quantidade de amostras. No entanto, um cromatógrafo preparativo convencional é geralmente menos complexo do que o cromatógrafo analítico.

Reservatórios de solventes[editar | editar código-fonte]

O reservatório de solvente é geralmente feito de vidro ou de aço inoxidável e deve ter uma capacidade adequada. Devido a quantidade maior de solvente que são empregadas na análise preparativa os reservatórios são maiores. Em geral, as maiorias das peças de um cromatógrafo preparativo são feitas a partir de aço inoxidável, no entanto, para substâncias biologicamente sensíveis, o uso de materiais biocompatíveis pode ser necessário para certas partes do aparelho.

Bombas para análise preparativa[editar | editar código-fonte]

A bomba deve ter capacidade adequada, diâmetro, as taxas de bombeamento de pelo menos 150 ml / min. Para colunas maiores, taxas de bombeamento de 500 ml a 1 litro por min. podem ser necessárias. Devido à força limitada de colunas com grande diâmetro pressões maiores de 6000 psi não são muito utilizadas. Em cromatografia preparativa, a amostra é, geralmente introduzida na coluna por uma bomba separada que tem seu próprio reservatório de amostra.

Detectores para cromatografia preparativa[editar | editar código-fonte]

Os detectores para cromatografia preparativa podem ser destrutivos ou não, quando destrutivos, é preciso usar uma válvula de separação da amostra antes do detector. Assim uma pequena quantidade de amostras vai para o detector e a outra, maior, vai para o coletor de amostra. É interessante que o detector utilizado não seja muito sensível, pois as amostras são muito mais concentradas do que em cromatografia analítica.

Coletores de Frações[editar | editar código-fonte]

 A maior diferença entre a cromatografia líquida analítica e a preparativa é o que acontece com a amostra, após a saída da coluna. Considerando que a amostra segue diretamente para o recipiente de resíduos na cromatografia líquida analítica, na cromatografia preparativa existe o coletor de frações.  O coletor de frações desvia o fluxo para um recipiente, usando uma válvula de desvio que pode ser ligada, por exemplo, por programação de tempo ou com base no sinal do detector.  A amostra é recolhida como uma solução com a fase móvel e recuperada por evaporação.  

Cromatografia de troca iônica[editar | editar código-fonte]

Nos anos de 1850, é encontrado o documento mais antigo sobre cromatografia de troca iônica. Depois desse ano, cientistas descreveram vários artigos métodos específicos para moléculas diferentes [5].

A partir de 1956 houve uma metodologia otimizada na separação de aminoácidos, mas o sistema tinha baixa pressão da fase móvel e de todo o sistema, pois havia uma amostra complexa de mistura biológica da amostra, e assim a análise podia demorar vários dias.

Com isso o segmento da bioquímica necessitou automatizar técnicas analíticas computacionais, o que se realizou com o desenvolvimento das técnicas de HPLC (High Performance Liquid Chromatography).

Um grande número de fases estacionárias foram desenvolvidas e agora são resistentes à pressão e capazes de otimizar a cromatografia de troca iônica usando alta pressão, propiciando a separação de misturas complexas em um menor tempo de corrida.

A popularização dessa técnica tem aumentado atualmente, devido à técnica possuir capacidade de analisar uma enorme variedade de moléculas em áreas farmacêuticas, biotecnológicas, meio ambiente, agricultura e outros segmentos industriais [2].

Princípio[editar | editar código-fonte]

Cromatografia de troca iônica (IEC) é uma importante técnica analítica para a separação e determinação de compostos iônicos juntos com interação / partição de íons e cromatografia de exclusão de íons [1].

Separação da cromatografia iônica é baseada nas interações eletrostáticas ou iônicas entre analitos iônicos e polares presentes no eluente e os grupos iônicos funcionais fixados no suporte cromatográfico.

A fase móvel é um sistema de tampão aquoso no qual a mistura de íons tem que ser a ideal para o tipo de amostra a ser analisada. A fase estacionária é usualmente feita de uma matriz orgânica e quimicamente inerte com grupos funcionais ionizáveis (Íons fixos que carregam cargas iônicas opostas).

Separação é baseada na ligação de analitos para grupos carregados positivamente ou negativamente que são fixados na fase estacionária e que estão em equilíbrio com íons livres na fase móvel de acordo com diferenças nas suas superfícies carregadas eletricamente [7].

Mecanismos diferentes acontecem com a blindagem, atração de íons competitivos e a exclusão iônica de acordo com a repulsão entre analitos carregados similarmente e os íons fixados no suporte cromatográfico [2].

Aplicação[editar | editar código-fonte]

É a cromatografia mais importante na separação de peptídeos, proteínas, ácidos nucleicos e biopolímeros (moléculas carregadas com tamanhos e naturezas moleculares diferentes) [3].

A separação é baseada na formação de ligações iônicas entre os grupos carregados das biomoléculas e o gel suporte carreador da troca iônica de carga oposta [4].

O princípio é de que na fase móvel há íons trocadores de cargas elétricas, isso é grupo de trocadores de íons são adicionados na resina ou gel e competem por um lugar na superfície da fase estacionária, conforme demonstrados na tabela 1 abaixo:

Trocador de íons

Forte

Fraco

Catiônico

SO3-2

COO-

Aniônico

NR3+

NH3+

Tabela1 exemplos de trocadores iônicos.

Algumas pré-condições são essenciais para garantir condições ótimas de funcionamento:

-O tipo de trocador iônico,

-O pH da fase móvel,

-A força iônica (concentração) da fase móvel,

-O tipo de troca iônica da fase móvel,

-A densidade eletrônica dos íons envolvidos.

O trocador iônico prefere:

-Íon com maior carga, pois tem maior quantidade de cargas concentradas em sua eletrosfera,

-Íon com menor diâmetro, pois suas cargas positivas do núcleo do átomo agem com maior intensidade na ionização de outros íons,

-Íon com maior polarizabilidade (grande potencial para mover a carga elétrica, melhor capacidade de indução de dipolo). Íons que podem ser prontamente polarizáveis são chamados de levemente polarizáveis e íons que não são tão fáceis de dificilmente polarizáveis.

Importante[editar | editar código-fonte]

-Trocadores iônicos com base de sílica se dissolvem em pH abaixo de 1 e maiores do que 9.

-Ácidez forte dos trocadores catiônicos (pH abaixo de 2 ) ou fortemente básicos dos trocadores aniônicos (pH acima de 10) podem catalisar reações laterais.

A cromatografia de troca iônica, também conhecida como cromatografia de adsorção, é um método útil e popular com [8]:

-alta capacidade de resposta

-alto poder de resolução

-condições de separar detalhadamente a amostra

-relativo custo baixo

Componentes gerais básicos[editar | editar código-fonte]

-Bomba com alta pressão e indicador de fluxo para controlar o eluente

-Um injetor para carrear a amostra no fluxo do eluente e para a coluna

-Uma coluna para separar a mistura de amostra em componentes individuais

-Um forno opcional

-Um detector para medir os espectros (picos) do analito, conforme o eluente sai da coluna

-Um sistema de dados (computador) capaz de coletar, organizar, integrar os dados do cromatograma

Resumindo:

Reservatório com solvente – Bomba – Indicador de fluxo e pressão – Unidade de injeção (auto-amostrador) – Coluna – Detector – Processador de dados

Condutor de condutividade é o mais comum usado na cromatografia de troca iônica na parte da detecção. Entretanto lâmpada de UV e outros detectores também podem ser utilizados [6].

Pode ser utilizada na separação e purificação de muitas moléculas carregadas ou ionizáveis tais como proteínas, peptídeos, enzimas, nucleotídeos, DNA, antibióticos, vitaminas entre outras substâncias de fontes naturais ou origem sintética.

Conforme houve o aumento do interesse pela cromatografia líquida por causa do aumento da demanda pela indústria farmacêutica, aumentou a necessidade de se ter métodos cromatográficos mais precisos nas técnicas de isolar moléculas bioativas de diferentes fontes [9].

Cromatografia de troca iônica tem muitas vantagens, a técnica é facilmente transferida para escalas de produção com baixo custo, altos níveis de purificação podem ser atingidos na etapa de purificação com a molécula desejada [8].

Ainda é alvo de contínuos desenvolvimentos e otimizações de metodologias e novas tecnologias.

Cromatografia de Par Iônico[editar | editar código-fonte]

A Cromatografia de Par Iônico não é mais que uma modificação engenhosa da Cromatografia de Fase Reversa, resumindo-se a utilizar-se no eluente uma solução de molaridade próxima a 0,005 M de fosfato de tetrabutilamônio (separação de ácidos orgânicos) ou de ácidos alquilsulfônicos de cadeias lineares de 5, 6, 7 ou 8 átomos de carbono (separação de bases orgânicas).

Como é fácil de concluir, ácidos e bases não interagem facilmente com a superfície hidrofóbica das colunas de fase reversa (especialmente C18), devido à carga associadas a estas espécies; com a adição à fase móvel dos sais referidos, de carga contrária a das moléculas da amostra, permite-se que as mesmas e o sal reagente formem um par eletronicamente neutro, podendo então interagir com a fase estacionária por um mecanismo de partição. Os modelos químicos das reações de par iônico são:

— ácidos (meio básico):

R-COO(-) + (+)N (C4H9)4 <—> [R-COO(-)(+)N(C4H9)4]

(ác. orgânico) (reagente PIC)                (par iônico)

— bases (meio ácido):

R-NH3(+) R'S03(-) <—> R-NH3(+)(-)S03-R1

(amina)  (reagente PIC)          (par iônico)

O comprimento da cadeia dos ácidos alquilsulfônicos é um fator a considerar: quanto maior a cadeia, maior a retenção, ou seja, se utilizarmos como reagente PIC o ácido octasulfônico (C8H17SOOH), este originará uma maior retenção dos compostos básicos da amostra do que a que se originaria ao utilizar o ácido pentanosulfônico (C5H9SOOH), sendo desta forma um fator de controle da separação. Outros fatores que podem ainda influenciar a separação serão a concentração do sal reagente, o pH da fase móvel e o tipo e a concentração do tampão a utilizar.[10]

A cromatografia de par iônico representa uma alternativa para a cromatografia de troca iônica. Muitos problemas podem ser resolvidos por qualquer um dos métodos, mas a troca iônica não é tão boa para separar misturas de produtos ácidos, básicos e neutros sob certas circunstâncias,  e aí é onde a cromatografia de pareamento iônico aparece e se destaca. O fato de que as fases reversas podem ser usadas como fases estacionárias aumentou sua popularidade. (MEYER,2010)

            Amostras iônicas podem ser separadas por cromatografia de fase reversa ,uma vez que elas contenham apenas ácidos fracos ou bases fracas (além de compostos neutros) presentes na forma não dissociada, como determinado pelo pH escolhido; o que é conhecido como “supressão iônica”.

A cromatografia de par iônico é uma extensão deste princípio. Uma substância orgânica iônica é adicionada à fase móvel e forma um par iônico com o componente da amostra de carga oposta. De fato, este par é um sal, mas seu comportamento cromatográfico é de uma molécula orgânica não iônica:

            amostra+ + contra-íon-  --> par [ amostra+ contra-íon-

                amostra- + contra-íon+  --> par [ amostra- contra-íon+ ]

A cromatografia em fase reversa pode ser usada nesta situação. Um alquilsulfonato é adicionado a amostras catiônicas e fosfato de tetrabutilamonio para amostras aniônicas. Uma amostra contendo componentes tanto catiônicos quanto aniônicos terá um componente “mascarado” pelo contra-íon e o outro suprimido por um nível adequado de pH. (MEYER, 2010)

Nota: o processo não pode ser usado com ácidos e bases fortes porque estes estão dissociados por uma ampla faixa de pH e seria necessário níveis de pH extremos para a supressão iônica.

Vantagens da Cromatografia de Par Iônico[editar | editar código-fonte]

As vantagens da cromatografia de par iônico para a separação de amostras iônicas podem ser sumarizadas a seguir:

(a)  os sistemas cromatográficos de fase reversa podem ser usados para a separação;

(b)  misturas de produtos ácidos, básicos e neutros, como também moléculas anfotéricas (que possuem um grupo catiônico e um grupo aniônico) podem ser separadas;

(c)  a seletividade pode ser influenciada pela escolha do contra-íon;

A cromatografia de par iônico é adequada para todos os compostos iônicos, mas nem todos os contra-íons são bons em todos os casos.

A tabela abaixo lista alguns contra-íons adequados para cromatografia de fase reversa com metanol-água ou acetronitrila-água de fase  móvel:

TABELA 1 – Aplicabilidade dos diferentes contra-íons

Contra-íon

Adequado para

Aminas quaternárias, p.ex. tetrametil-,

tetrabutil-, palmitiltrimetilamonio

Ácidos fortes ou fracos, pigmentos corantes sulfonados, ácidos carboxílicos

Aminas terciárias, p.ex. trioctilamina

sulfonatos

Sulfonatos de alquila e arila, p.ex., metano e

heptanossulfonato, ácido canforsulfônico

Bases fortes e fracas, sais e benzalcônio, catecolaminas

Ácido perclórico

pares iônicos muito fortes com uma variedade de amostras básicas

Alquil sulfatos, p.ex. lauril sulfato

Similar aos ácidos sulfônicos, diferente seletividade

(MEYER,2010)

Reagentes de par iônico[editar | editar código-fonte]

Há duas regras simples ao escolher o reagente de par iônico. A primeira regra é que íons hidrofílicos são melhor separados usando um reagente de par iônico hidrofóbico e que analitos hidrofóbicos são melhor separados com um reagente de par iônico hidrofílico. Reagentes comuns estão listados abaixo por ordem crescente de hidrofobicidade:

Para análise de ânions, reagentes de par iônico incluem amônia e tetrametil-, tetraetil-, tetrapropil-, e tetrabutilamônio.

Para análise de cátions, reagentes de par iônico incluem ácidos clorídrico, perclórico, e perfluorocarboxílicos e ácidos pentano-, hexano-, heptano-, e octano-sulfônicos. Ácidos perfluorocarboxílicos possuem a vantagem da baixa condutância e estão disponíveis com pureza extremamente alta; eles são úteis para a separação de cátions muito hidrofóbicos. [11]

Concentração do Reagente[editar | editar código-fonte]

Devido a capacidade efetiva de a coluna ser determinada principalmente pelo reagente de par iônico, a retenção do analito aumentará na medida em que a concentração do reagente é aumentada. Entretanto, a repulsão eletrostática das moléculas do reagente na superfície da fase estacionária em última análise irá limitar o quanto a capacidade da coluna pode ser aumentada. A concentração do reagente de par iônico é também limitada pela capacidade do supressor. As concentrações de trabalho típicas variam de 0.5 a 20 mM. [11]

Há um bom número de misturas reagentes em soluções tampão disponíveis no mercado, embora muitos pesquisadores/analistas prefiram preparar seus próprios “coquetéis” de fase móvel para adequar a seu problema em particular. Alguns exemplos são listados a seguir:

(a)  Fosfato de tetrabutilamonio, +N(C4H9)4, tamponado a pH 7,5, forma pares com ácidos fortes e fracos e o tamponamento suprime os íons básicos;

(b)  Ácidos alquilsulfônicos, -SO3(CH2)nCH3 com n = 4-7, tamponado a pH 3,5, forma pares iônicos com bases fortes e fracas e o tamponamento suprime os íons ácidos fracos. Quanto maior a cadeia alquila, maior é o tempo de retenção.

Moléculas anfotéricas, tais como o ácido  p-aminobenzóico (H2NC6H4COOH, onde o NH2 é a função básica e o COOH é a função ácida), podem ser cromatografadas com ambos os reagentes citados acima. A função ácida forma par iônico com o primeiro grupo e o grupo amino permanece indissociado como resultado do tamponamento. O inverso se aplica ao segundo grupo de reagentes.

Os únicos problemas são causados pelas misturas de ácidos fortes e fracos com bases foretes e fracas. Ou as bases fortes ou os ácidos fortes estão na forma iônica. Entretanto, este tipo de mistura é raro.

Os valores de k’ são proporcionais a concentração do contra-íon, de modo que os tempos de retenção são afetados não somente pelo tipo mas também pela concentração do reagente de par iônico. Sob certas circunstâncias, podem ser usados dois reagentes ao invés de um, para otimizar um problema de separação, p.ex. uma mistura de ácidos pentano- e octanosulfônico. Claro, os tempos de retenção também podem ser ajustados alterando-se a quantidade de solvente orgânico na fase móvel e outros procedimentos de otimização, incluindo a adição de compostos competidores.

Sais quaternários de amônio em meio alcalino são extremamente danosos para a sílica. É altamente recomendado em tais situações, o uso de uma coluna de saturação, colocada na frente do injetor, na qual a fase móvel é saturada com sílica. (MEYER, 2010)

Orientações para a cromatografia de pareamento iônico:[editar | editar código-fonte]

(a)  Recomenda-se que seja usada quando outros métodos tais como os modos cromatográficos fase reversa e supressão iônica tenham falhado ou quando a amostra contenha tanto componentes não-iônicos quanto iônicos;

(b)  Recomenda-se usar uma mistura metanol-água como fase móvel, minimizando assim problemas de solubilidade do contra-íon. A acetonitrila é preferida se a seletividade não for satisfatória, mas as propriedades de solubilidade podem ser diferentes neste caso;

(c)  A escolha do contra-íon correto é importante, com as variedades de cadeia curta sendo preferidas para amostras com bem pouca diferença na estrutura molecular e as variedades de cadeia longa, hidrofóbicos, preferidos se uma retenção maior é requerida.

(d)  A solubilidade do contra-íon deve ser checada para todas as proporções de mistura da fase móvel possíveis durante a análise (eluição por gradiente);

(e)  Recomenda-se que o pH da fase móvel seja escolhido de forma a prover a maior ionização da amostra, Entretanto, deve-se levar em consideração também a compatibilidade da sílica, como base da fase estacionária, ao pH (2-7,4);

(f)   Recomenda-se escolher uma fase reversa monomérica de C18 ou C8 para o teste inicial. Parece faltar estabilidade a cadeias alquilas menores;

(g)  Recomenda-se degaseificar a fase móvel antes da adição do contra-íon, para prevenir a formação de espuma (especialmente relevante quando compostos de cadeia longa, similares a detergentes são usados);

(h)  Concentração: recomenda-se que o reagente de par iônico seja usado no intervalo de 50-200mM (preferencialmente uma concentração mais baixa se um contra-íon de cadeia longa é utilizado e vice-versa). Se houver a necessidade de usar solução tampão para manter o pH no nível requerido, então quantidades iguais devem ser adicionadas a todos os solventes envolvidos no caso de eluição por gradiente. Recomenda-se que os componentes do tampão seja pobre como par iônico, mas tenha boa solubilidade.

(i)    Em termos de otimização da separação por gradiente, mudança no contra-íon ou nas concentrações do tampão, se a amostra contém tanto componentes iônicos quanto não iônicos, então os não-iônicos devem ser otimizados primeiro e deve-se buscar um contra-íon que elua os íons a tempos de retenção favoráveis;

(j)    Recomenda-se não desligar as bombas enquanto houver contra-íon na tubulação e na coluna. À noite, o fluxo pode ser reduzido para 3-5 ml h-1 para prevenir a precipitação de sal;

(k)  É necessário verificar a transparência ao UV dos contra-íons.

Três dicas adicionais:

(l)    Amostras maiores são melhor separadas se a amostra está na forma de par iônico antes da adição na coluna. Uma quantidade aproximadamente estequiométrica de contra-íon é adicionada à solução da amostra com este propósito, tomando-se o cuidado de assegurar a máxima ionização pelo ajuste do pH;

(m) Como regra geral, os reagentes de par iônico costumam ser danosos à silica da coluna;

Recomenda-se reservar colunas com o propósito estrito de serem usadas para cromatografia de pareamento iônico. (MEYER,2010)

Cromatografia de fase reversa[editar | editar código-fonte]

A cromatografia de fase reversa é uma técnica cromatográfica que separa componentes de uma mistura pela diferença de hidrofobicidade entre cada um deles . Nesse caso, a fase estacionária é mais hidrofóbica que a fase móvel, logo, resultando em uma retenção forte com analitos hidrofóbicos. A separação pode ser realizada tanto por eluição isocrática quanto por gradiente, separando com alta resolução componentes com pequena diferença de hidrofobicidade.

Como a cromatografia de fase reversa separa componentes de uma amostra por polaridade, moléculas polares são eluídas primeiro, preparações podem ser purificadas, concentradas e dessalinizadas em uma única corrida cromatográfica, fazendo dessa técnica uma alternativa ideal para ser acoplada com espectrometria de massas e cromatografia líquida multidimensional.

Funcionamento da cromatografia de fase reversa[editar | editar código-fonte]

A separação de moléculas na cromatografia de fase reversa é realizada por uma interação hidrofóbica e reversível, entre as moléculas do eluente e da fase móvel. Inicialmente, a fase móvel é polar, fazendo com que a área hidrofóbica do eluente voltada para a fase móvel seja minimizada, favorecendo a interação com a fase estacionária apolar. Quanto mais apolares forem as moléculas do eluente, maior será o tempo de retenção.

A cromatografia de fase reversa têm sua resolução e eficiência altamente influenciadas pelo empacotamento da coluna cromatográfica. A seletividade é influenciada pelo gradiente e pela escolha da fase móvel e da fase estacionária.

Componentes de uma cromatografia de fase reversa[editar | editar código-fonte]

Fase estacionária[editar | editar código-fonte]

Dois tipos de fase estacionária são comuns em cromatografia de fase reversa: Matriz de sílica e matriz polimérica.

Matriz de sílica[editar | editar código-fonte]

Matrizes de sílica foram desenvolvidas com o objetivo de purificar moléculas orgânicas e posteriormente, para peptídeos, aproveitando-se da estabilidade química da sílica para os valores de pH dos solventes normalmente utilizados em cromatografia de fase reversa. Normalmente, as cadeias n-carboxílicas aonde ocorrem as interações são ligadas à matriz via grupos silanol (SiOH).

Matriz de polímero[editar | editar código-fonte]

É uma matriz de polímeros (baseados em poliestireno, por exemplo) com estabilidade química mesmo à valores de pH extremos. São normalmente utilizados para separar misturas de proteínas ou peptídeos. Como a matriz de polímeros pode ser mais organizada que a matriz de sílica, apresenta taxas de fluxo maiores e a grande faixa de pH permite um melhor controle sobre a seletividade.

Fase móvel[editar | editar código-fonte]

Representação da interação de um analito hidrofóbico com a coluna de fase reversa
Representação da eluição de um analito hidrofóbico na cromatografia de fase reversa

Referências

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[2] Bhattacharyya L, Rohrer JS. Applications of Ion Chromatography for Pharmaceutical and Biological Products. New Jersey: John Wiley & Sons; 2012.

[3] Okada T. Nonaqueous ion-exchange chromatography and electrophoresis Approaches to nonaqueous solution chemistry and design of novel separation. Journal of Chromatography A 1998; 804 17-28.

[4] Stanton P. HPLC of Peptides and Proteins. Methods in Molecular Biology. New Jersey: Humana Press; 2004.

[5] Wisel A, Schmidt-Traub H, Lenz J, Strube J. Modelling gradientelution of bioactive multicomponent systems in non-linear ion-echange chromatography. Journal of Chromatography A 2003; 1006 101-120.

[6] Fritz JS, Gjerde DT. Ion Chromatography (Fourth Completely Revised and Enlarged Edition). Weinhein: Wiley-VCH Verlag GmbH &KGoA Weinhein; 2009.

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[9] Gerberding SJ, Byers CH. Preparative Ion-echange chromatography of proteins from dairy whey. Journal of Chromatography A 1998; 808 141-1511.   

[10] Boletim da Sociedade Portuguesa de Química, 39, 1990.   

[11] Methods Development Using Ion-Pair Chromatography with Suppressed Conductivity Detection – Dionex Technical Note 12   

ASHRAF-KHORASSANI, M; LEVY, J. M. Addition of modifier in supercritical fluid chromatography using a microbore reciprocating pump. Chromatographia. January 1995, Volume 40, Issue 1, pp 78-84

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