Nucleases CRISPR e morte microbiana direcionada

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A Biologia Molecular é uma área da ciência que teve origem em 1866 com os estudos de Gregor Mendel e foi responsável por uma grande revolução científica em 1953 com o descobrimento da estrutura do DNA por contribuições de Rosalind Franklin, James Watson e Francis Crick[1]. Porém, a partir de 1970, as possibilidades de manipulação de DNA foram aumentadas com o desenvolvimento da tecnologia de DNA recombinante, dando início aos conceitos de engenharia genética. O conceito de engenharia genética refere-se ao processo de realizar modificações direcionadas no genoma, modulando a função do DNA[2]. Nessa área, podemos destacar a tecnologia de CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats) juntamente com os genes Cas que é capaz de realizar essa edição direta do DNA em sistemas in vivo para diversas aplicações.

O sistema CRISPR[editar | editar código-fonte]

O CRISPR é uma ferramenta de edição gênica muito recente que é baseado em uma estratégia de defesa primária que pode ser encontrada em aproximadamente 40% dos genomas de bactérias e 90% dos genomas de archaeas. Nestes organismos, esse sistema fornece resistência adquirida contra ácidos nucleicos invasores, como fagos e elementos móveis como os plasmídeos conjugativos — aqueles responsáveis por mediar a conjugação (troca de material genético) e estes possuem toda a estrutura necessária para replicação autônoma e transferência do material genético[3][4][5]. A presença de DNA exógeno é responsável pela ativação do sistema de defesa bacteriano a partir da produção de enzimas Cas1 e Cas2 que dividem o material genético invasor em pequenos fragmentos que são inseridos no lócus do CRISPR juntamente com sequências de DNA não-codificantes da própria bactéria, chamadas de spacers, e essa estrutura gera sequências repetidas ou palindrômicas. Essa sequência introduzida no lócus do CRISPR gera uma memória adaptativa nestes organismos, possibilitando uma rápida resposta celular no caso de futuras invasões[6].

(Figure 4. [1]) Legenda: Figura 1: Mecanismos naturais de sistemas CRISPR microbianos em imunidade adaptativa. O contato com o DNA exógeno ativa o sistema de defesa bacteriano, armazenando a informação no lócus CRISPR. Em uma possível contato futuro com o mesmo DNA exógeno, o sistema de defesa bacteriano vai responder rapidamente a partir da síntese de crRNA [7].

É uma técnica baseada em endonucleases que podem ser especificamente direcionadas para sítios genômicos onde quebram a fita dupla de DNA e utilizam a própria maquinaria celular de repara, gerando alterações na sequência genômica como mutações, deleções, inserções e edições específicas[4]. Geralmente, as matrizes de CRISPR envolvem repetições diretas de 24-47 pares de bases que são separadas por sequências exclusivas que são chamadas de espaçadores e que são obtidas a partir de genomas virais ou pela inserção de um plasmídeo em um hospedeiro de interesse[7]. O sistema de CRISPR é formado por crRNA trans-ativadores (tracrRNAs) e uma proteína da família Cas[4]. As proteínas Cas fazem parte de um grupo heterogêneo de proteínas que possuem funções diversas com destaque para sua ação como nucleases, helicases, polimerases e proteínas de ligações a polinucleotídeos. As proteínas Cas também podem ser usadas como agentes antimicrobianos uma vez que a sequência de RNA guia pode direcionar a proteína para uma sequência genômica específica que, pode causar colapso da forquilha de replicação durante o processo de replicação de microrganismos e, consequentemente, levando à morte celular[8]. A proteína Cas9 é a mais utilizada na técnica de CRISPR, são guiadas por segmentos de RNA que geram quebra na dupla fita de DNA (DSBs - double-stranded DNA breaks) e esta foi adaptada para edição de genomas em vários organismos[8][9].

A proteína Cas9[editar | editar código-fonte]

O sistema CRISPR-Cas9 funciona a partir da integração do genoma do material genético invasor no lócus de CRISPR, onde estas sequências serão transcritas em pré RNAs de CRISPR (pré-crRNAs) que, após um processamento por enzimas Cas, gera diversas sequências pequenas de nucleotídeos (sequência palindrômica + spacers) que são os chamados crRNAs[4][6]. A maturação destes crRNAs ocorre através da transcrição do pequeno RNA trans-ativador em uma sequência upstream ao lócus CRISPR  e este é complementar à região repetida do transcrito de crRNA[6]. O modo de ação das proteínas Cas9 é controlado pela presença de crRNAs que forma um complexo ribonucleoproteico a partir de seu emparelhamento com um tracrRNA e com a proteína Cas9. A adaptação deste mecanismo bacteriano para edição genômica faz com que haja a presença de uma dupla fita de RNA guia, formada a partir da fusão do crRNA e tracrRNA, aumentando a especificidade do sistema e guiando a nuclease para a sequência alvo no DNA[1][6]. A especificidade da ação de proteína Cas9 depende da presença da sequência PAM (proto-spacer adjacent motive) que consiste em uma sequência de 2 a 3 bases nucleotídicas localizadas imediatamente adjacentes à sequência que a proteína Cas9 irá clivar[6]. Ao identificar a sequência PAM, o complexo ribonucleoproteico se liga à dupla fita de DNA, que será desenovelado, ocorre a formação de uma estrutura de heteroduplex de DNA-RNA guia e, após mudanças conformacionais da proteína Cas9, esta proteína pode clivar especificamente no local do DNA indicado a partir da hidrólise de ligações fosfodiéster (embora padrões de corte alternativos já tenham sido observados durante a ação desta nuclease)[9]. O início de estudos acerca das nucleases Cas9 se deu a partir da análise da clivagem programada de DNA em células de mamíferos a partir da nuclease obtida pela integração do genoma Streptococcus pyogenes (SpCas9) e Streptococcus pneumoniae (um patógeno comum que atinge o trato respiratório). Após esse estudo, muitas outras nucleases — que diferem em tamanho, sequência PAM de reconhecimento, comprimento dos spacers ideal e especificidade — foram obtidas a partir de outros organismos como Staphylococcus aereus, Streptococcus termophilus, Neisseria meningitidis e muitos outros organismos e muitos estudos testaram sua atividade em situações de edição gênica[9].

O microbioma humano[editar | editar código-fonte]

O microbioma humano constitui um sistema ecológico interessante responsável por funções essenciais na maturação de resposta do sistema imunológico humano, na produção de metabólitos e até mesmo em respostas do sistema neurológico. Estas características tornam o microbioma humano um bom alvo de terapias para indução de respostas desejáveis, e estas podem ser: (1) terapias aditivas responsáveis por complementar a microbiota do hospedeiro; (2) terapias subtrativas responsáveis por eliminar organismos causadores de doenças; (3) terapias modulatórias responsáveis por modular a composição do microbioma endógeno[10]. O Projeto do Genoma Humano possibilitou a disponibilização de centenas de dados metagenômicos que aumentam as possibilidades de exploração da enorme diversidade de CRISPRs associados a humanos conhecidos e que podem ser descobertos[3]. Nesse sentido, o sistema de CRISPR/Cas pode ser usado de diversas maneiras como forma de caracterização do microbioma humano mas duas aplicações interessantes desta tecnologia surgem durante a análise de funções que um determinado microrganismo pode exercer no corpo humano e no controle de doenças patogênicas. A técnica de CRISPR já se mostrou uma importante ferramenta para regulação seletiva de genes e, esta também pode ser usada na regulação seletiva de bactérias presentes em populações microbianas complexas, constituindo importantes mecanismos de morte direcionada através de sua ação eficiente e específica[7].

Mecanismos de morte microbiana direcionada[editar | editar código-fonte]

Os sistemas CRISPR-Cas podem ser prontamente utilizados para alterar genomas de bactérias probióticas associadas ao microbioma, podem ter ação microbiana contra patógenos específicos sem afetar os outros organismos que compõem a complexa população microbiana que vive em simbiose com os humanos e podem, ainda, controlar a expressão gênica sem necessariamente alterar o genoma[7]. Existem alguns problemas relacionados à utilização do CRISPR neste processo de morte microbiana direcionada. O primeiro ponto é que, durante este processo, algumas células-alvo são capazes de sobreviver através de um mecanismo de deleção de fragmentos de DNA que se encontram nas proximidades da sequência de DNA alvo da proteína Cas. Como, nesse caso, o DNA é modificado pela maquinaria de reparo celular, a proteína Cas não é mais capaz de reconhecer a sequência PAM e a clivagem não ocorrerá. Este fator gera uma questão com relação à falta de controle no processo mas também é útil na remoção de elementos genéticos indesejados. O segundo ponto está relacionado à eficiência dos vetores de entrega, o que depende da eficiência dos sistemas de conjugação de plasmídeos contendo CRISPR. Em uma cultura celular onde há baixa frequência de conjugação, há um fator de morte mediada por CRISPR limitado[7].

Um exemplo da aplicação da tecnologia de CRISPR-Cas para morte dirigida em populações microbianas pode ser dado pelo estudo que foi realizado em E. coli e S. aureus onde um plasmídeo contendo a sequência codificante da proteínas Cas9, os RNAs guia e sequências de resistência a antibióticos foram injetados em populações bacterianas e a morte direcionada foi observada quando observou-se a presença do DNA alvo e quando a frequência de conjugação era alta. Em outro estudo usando Staphylococcus aureus, um fago foi construído e empacotado em um plasmídeo contendo o sistema CRISPR-Cas, construindo um fagemídeo. Essa estrutura foi testada para genes de resistência a antibióticos e fatores de virulência e demonstraram que este tipo de sistema de infecção pode ser útil na eliminação de espécies microbianas de interesse em meio a uma população microbiana complexa tanto em ambientes in vivo como in vitro. Atualmente, existe um número crescente de estudos nesta área que abordam diferentes técnicas de infecção, uso de nucleases de diferentes origens, uso de diferentes alvos, diferentes objetivos com relação ao microbioma humano e muitas outras variações.

(Figure 2. [2]) Legenda: Figura 2: Morte, edição de genoma ou modulação da expressão gênica por sistemas CRISPR-Cas. Os sistemas CRISPR-Cas podem ser entregues às bactérias alvo in vitro ou in vivo por meio de transformação, transdução ou conjugação[10].

Conclusão[editar | editar código-fonte]

A ferramenta de CRISPR representou uma grande revolução nos estudos da genômica e da metagenômica e esta tecnologia abre possibilidades para infinitas possibilidades com relação a estratégias de edição de sequências genômicas. Mas, além disso, o CRISPR também surge como uma solução para diversas limitações que aparecem continuamente no mundo atual em constante evolução. Neste trabalho, o sistema CRISPR-Cas foi abordado como um importante mecanismo para modulação da população microbiana do microbioma humano e, nesse sentido, o CRISPR é uma ferramenta que pode controlar seletivamente espécies patogênicas responsáveis por diversas doenças. Sabe-se que muitas populações microbianas tendem a formar biofilmes, que são estruturas tridimensionais complexas e de difícil controle uma vez que, atualmente, há a ocorrências de organismos multirresistentes a antibióticos e diversas substâncias de caráter antimicrobiano. Dessa forma, o CRISPR constitui uma estratégia interessante ao combate de biofilmes que, hoje, já são responsáveis por milhares de mortes por infecção ao redor do mundo e por diversos prejuízos econômicos nos setores industriais. Os bons resultados de CRISPR aplicados em S. pyogenes abriram infinitas possibilidades de futuras aplicações, que foram potencializadas pelo avanço do Projeto Genoma Humano. Com relação ao microbioma humano, esse conhecimento possibilitou o desenvolvimento de muitas possibilidades de tratamentos terapêuticos para diversas doenças infecciosas, metabólicas, imunológicas e neurológicas[7]. Apesar da tecnologia CRISPR ser totalmente revolucionária, deve-se entender que os resultados da clivagem de DNA por proteínas Cas possui uma enorme variedade de acordo com cada elemento que é utilizado no processo e, além disso, existem barreiras para inserção de DNA exógeno em muitas espécies microbianas. Logo, as estratégias ao se aplicar o CRISPR devem ser muito planejadas devido à heterogeneidade da técnica e pelo fato de as complexas interações microbianas em uma população serem, ainda, pouco elucidadas. Tomando os devidos cuidados, o CRISPR pode ser utilizado para infinitas aplicações e, nesse aspecto, é importante ter cuidado com relação às barreiras bioéticas.

Referências[editar | editar código-fonte]

  1. a b Olby, Robert (agosto de 1999). «Molecular biology: a history of the recent past». Trends in Genetics (8): 335–336. ISSN 0168-9525. doi:10.1016/s0168-9525(99)01781-3. Consultado em 12 de novembro de 2020 
  2. Hsu, Patrick D.; Lander, Eric S.; Zhang, Feng (junho de 2014). «Development and Applications of CRISPR-Cas9 for Genome Engineering». Cell (6): 1262–1278. ISSN 0092-8674. PMC 4343198Acessível livremente. PMID 24906146. doi:10.1016/j.cell.2014.05.010. Consultado em 12 de novembro de 2020 
  3. a b Rho, Mina; Wu, Yu-Wei; Tang, Haixu; Doak, Thomas G.; Ye, Yuzhen (13 de junho de 2012). Guttman, David S., ed. «Diverse CRISPRs Evolving in Human Microbiomes». PLoS Genetics (em inglês) (6): e1002441. ISSN 1553-7404. PMC 3374615Acessível livremente. PMID 22719260. doi:10.1371/journal.pgen.1002441. Consultado em 12 de novembro de 2020 
  4. a b c d BENJAMIN, LEWIN (2014). LEWIN'S GENES XII. [S.l.]: Jones & Bartlett Learning. p. 285 
  5. «TROCA DE INFORMAÇÃO GENÉTICA ». www.microbiologybook.org. Consultado em 12 de novembro de 2020 
  6. a b c d e «Tecnologia CRISPR-Cas para edição genômica. - Portal Embrapa». www.embrapa.br. Consultado em 12 de novembro de 2020 
  7. a b c d e f «Development and Applications of CRISPR-Cas9 for Genome Engineering». Cell (em inglês) (6): 1262–1278. 5 de junho de 2014. ISSN 0092-8674. doi:10.1016/j.cell.2014.05.010. Consultado em 12 de novembro de 2020 
  8. a b Hamilton, Thomas A.; Pellegrino, Gregory M.; Therrien, Jasmine A.; Ham, Dalton T.; Bartlett, Peter C.; Karas, Bogumil J.; Gloor, Gregory B.; Edgell, David R. (dezembro de 2019). «Efficient inter-species conjugative transfer of a CRISPR nuclease for targeted bacterial killing». Nature Communications (em inglês) (1). 4544 páginas. ISSN 2041-1723. PMC 6778077Acessível livremente. PMID 31586051. doi:10.1038/s41467-019-12448-3. Consultado em 12 de novembro de 2020 
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  10. a b Ramachandran, Gayetri; Bikard, David (13 de maio de 2019). «Editing the microbiome the CRISPR way». Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences (em inglês) (1772). 20180103 páginas. ISSN 0962-8436. PMC 6452265Acessível livremente. PMID 30905295. doi:10.1098/rstb.2018.0103. Consultado em 12 de novembro de 2020