Reação em cadeia da polimerase

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Termociclador, Aparelho utilizado para realizar uma PCR

Reacção em cadeia da polimerase (em inglês Polymerase Chain Reaction - PCR) é um método de amplificação (de criação de múltiplas cópias) de DNA (ácido desoxirribonucleico) sem o uso de um organismo vivo, por exemplo, Escherichia coli (bactéria) ou leveduras.

Inventada em 1983 por Kary Mullis, a PCR é uma das técnicas mais comuns utilizadas em laboratórios de pesquisas médicas e biológicas para diversas tarefas, como o sequenciamento de genes e diagnóstico de doenças hereditárias, identificação de fingerprint genético (usado em testes de paterninade e na medicina forense), detecção de diagnóstico de doenças infecciosas e criação de organismos transgênicos.

História[editar | editar código-fonte]

O processo de PCR foi descrito por Kary Mullis,em 1983, tendo-lhe sido posteriormente, em 1993, atribuído o Prémio Nobel da Química pelo seu trabalho. Em 1989, a Hoffman La Roche & Perkin-Elmer Corporation patenteou este processo. O método PCR é usado habitualmente nos laboratórios de investigação médica e biológica para uma variedade de tarefas, como a detecção de doenças hereditárias, que é a identificação de "impressões digitais" genéticas, a construção de árvores filogenéticas (árvores de relação entre espécies), a clonagem de genes (ver adiante), testes de paternidade, exames para detecção de agentes patogênicos e etc.

Aplicações[editar | editar código-fonte]

A PCR encontra sua principal aplicação em situações onde a quantidade de DNA disponível é reduzida. Em teoria, é possível amplificar qualquer DNA. Uma das principais aplicações da PCR é na medicina forense, onde pequenas amostras de DNA retiradas da cena de um crime (pedaços de cabelo que contenham bulbo, gotas de sangue ou saliva, pedaços de pêlo ou até mesmo a minúscula quantidade de DNA deixada em uma impressão digital) são amplificadas para serem analisadas pelo método de fingerprinting. O PCR também é rotineiramente utilizado em procedimentos científicos de Biologia Molecular como amplificação para gerar mutagênese, detecção de mutações ou preparação de fragmentos de DNA para clonagem (inserção em plasmídeo, por exemplo) como também pode ser utilizado para identificação de patógenos que estão presentes em amostras como por a exemplo identificação de agentes como Cândida sp, Chlamydia trachomatis, HPV Vírus do papiloma humano e seus genótipos, HIV Vírus da Hepatite B. etc A PCR também é utilizada na paleontologia para o sequenciamento gênico de animais pré-históricos. Também é muito utilizada na identificação de microrganismos, tendo em vista que apenas 1% dos microrganismos são cultivaveis e podendo ser isolados. A PCR é o primeiro passo para o posterior sequenciamento. Após obter as sequencias geradas pelos equipamentos pode-se consultar bases de dados na internet para tentar localizar suas possiveis origens, sendo bactérias, archeas ou etc.

Procedimentos[editar | editar código-fonte]

Oito tubos de PCR, cada tubo contendo 100μl.

A Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) é um método muito sensível de análise e por isso é realizado com muito cuidado para evitar contaminações que possam inviabilizar ou tornar errôneo o resultado. O processo consiste basicamente em utilizar os mecanismos da replicação in vitro. Os cientistas então simplificaram ao máximo o processo de polimerização das moléculas. A maquinaria para separar as fitas sense e anti-sense são muito complexas na célula, no lugar utiliza-se a mudança de temperatura. Os ciclos são pensados para disponibilizar o sitio alvo para a ligação dos primers, funcionamento da polimerase e iniciou de um novo ciclo. Em primeiro lugar, deve-se extrair o material genético da célula ou outro material a ser estudado (exemplo: vestígios de crimes) sem danificá-lo. Normalmente o material extraído é o DNA (ADN), mas pode-se trabalhar com o RNA (ARN) em uma RT-PCR que é um desdobramento da PCR e possui outras aplicações.

Resultado da PCR após ser realizada uma eletroforese em gel de agarose ou de poliacrilamida.

Depois de extraído o DNA, a este é adicionada uma mistura (também conhecida como pré-mix) que contém os dNTPs (desoxirribonucleotídeos trifosfatos), que são as bases nitrogenadas ligadas com um três fosfato, os primers (também chamados de oligonucleotídeos ou iniciadores) e a enzima DNA polimerase em uma solução tampão. Toda esta mistura é colocada no termociclador, o qual faz ciclos de temperatura pré-estabelecidos com tempos exatos específicos para cada reação (fragmento a ser amplificado).

Na primeira etapa do ciclo a temperatura é elevada de 94 a 96 °C por pouco tempo para que haja a separação da dupla cadeia de DNA (Desnaturação, quebra das pontes de hidrogênio). Na segunda etapa, a temperatura é reduzida entre 50 a 60 °C dependendo da quantidade de citosina (C) e guanina (G) encontrada no primer, para que os primers se anelem (emparelham) com a fita molde de DNA (anelamento). Na última etapa do ciclo a temperatura é elevada a 72 °C para que a enzima possa funcionar sintetizando a nova molécula (extensão), em seguida um novo ciclo é iniciado. Normalmente são realizados de 25 a 40 ciclos para cada reação na qual a taxa de replicação é exponencial 2^{ciclos}

O resultado é analisado através de uma eletroforese em gel de agarose ou de poliacrilamida e depois é interpretado com a ajuda de um profissional competente. Geralmente um padrão de peso molecular é adicionado em uma das fileiras do gel, assim poderá se avaliar o tamanho do fragmento amplificado

Variações da técnica basica de PCR[editar | editar código-fonte]

Nested PCR[editar | editar código-fonte]

Utilizado para aumentar a quantidade de produto amplificado final ou para aumentar a sensibilidade da técnica. Suas reações requerem dois pares de primers, um par mais externo para a 1a reação (round) e outro interno ao produto do 1a reação. A 1a reação necessita de um maior tempo de extensão devido ao maior tamanho do produto a ser amplificado, em seguida adiciona-se uma alíquota da 1a reação, que servirá de molde na mistura (mix) da 1a reação. O produto da 1a reação normalmente não é notado em corrida em gel de agarose, por outro lado o produto da 2a reação gerado em grande quantidade, sim, por isso pode ser visualizado na corrida eletroforética ou utilizado para sequenciamento.

Hot Start[editar | editar código-fonte]

A reação de PCR é ativada quando a temperatura atinge 940C. Esse procedimento aumenta a especificidade da PCR, pois a DNA polimerase contém um anticorpo, que se desnatura e ativa a enzima ao atingir a temperatura de 940C. DNA polimerases que não possuem esse inibidor podem amplificar produtos indesejados (inespecíficos) em temperatura ambiente.

Galeria de imagens[editar | editar código-fonte]

Bibliografia[editar | editar código-fonte]

  • Saiki, R. K., D. H. Gelfand, S. Stoffel, S. J. Scharf, R. Higuchi, G. T. Horn, K. B. Mullis, and H. A. Erlich. "Primer-Directed Enzymatic Amplification of DNA with a Thermostable DNA Polymerase." Science 239 (1988): 487-491.
  • United States Patent 5,656,493 Mullis, et al. August 12, 1997: System for automated performance of the polymerase chain reaction

Ver também[editar | editar código-fonte]

Ligações externas[editar | editar código-fonte]

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