Recombinação Cre-Lox

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Recombinação Cre-Lox é uma tecnologia de recombinação sítio-específica, cujo nome vem do uso da enzima Cre recombinase e sítios loxP[1]. Derivada do mecanismo natural de recombinação do bacteriófago P1[2], a recombinação Cre-Lox é utilizada para diversos usos científicos e tecnológicos, notavelmente inserções, deleções, inversões e translocações sítio-específicas em sequências de DNA. Diz-se que uma sequência é “floxed” quando está flanqueada por sítios Lox.

Um dos usos mais conhecidos da recombinação Cre-Lox é a criação de animais nocaute condicionais[3], onde a modificação desejada ocorrerá apenas após um estímulo desejado. Isso permite a alteração de sequências de DNA em tecidos específicos ou em momentos específicos do desenvolvimento, driblando possíveis efeitos letais se a alteração ocorresse globalmente.

Histórico[editar | editar código-fonte]

Este tipo especial de recombinação sítio-específica foi desenvolvida primeiramente pelo Dr. Brian Sauer, usada ativando expressão gênica em células de mamífero[4][5]. Sequencialmente, pesquisadores no laboratório do Dr. Jamey Marth demonstraram que a recombinação Cre-Lox poderia ser usada para deletar sequências de DNA flanqueadas por sítios loxP em eficiências altas em células T de animais transgênicos, com os autores propondo que essa abordagem poderia ser usada para definir a função gênica endógena em tipos celulares específicos, marcar progenitores em estudos de determinação de destino celular, induzir rearranjos cromossômicos específicos para modelagem biológica e de doenças e determinar os papéis de lesões genéticas precoces na manutenção de doenças[6].

Logo depois, pesquisadores no laboratório do Prof. Klaus Rajewsky relataram a produção de células iPS carregando um gene de DNA polimerase flanqueado por loxP[7]. Combinando esses avanços em colaboração, os laboratórios dos Drs. Marth e Rajewsky relataram em 1994 que a recombinação Cre-Lox poderia ser usada para modificação condicional de genes em células T em desenvolvimento em camundongos[8]. Eles observaram que aproximadamente 50% do gene da DNA polimerase beta havia sido deletado. Ainda estava incerto se apenas um alelo havia sido deletado em cada célula T ou se metade das células T haviam delatedo ambos os alelos.. Pesquisadores relataram então recombinação Cre-Lox condicional mais eficiente no laboratório Marth em 1995[9]. Deleção incompleta de genes em células com dois alelos flanqueados por sítios loxP não é incomum.

Independentemente, Joe Z. Tsien foi pioneiro no uso do sistema Cre-Lox para manipulação de modo específico a nível de célula e região no cérebro adulto, onde centenas de tipos neuronais podem existir e onde quase todos os neurônios no adulto são pós-mitóticos[10]. Tsien e colaboradores mostraram que recombinação mediada por Cre pode ocorrer nos neurônios piramidais pós-mitóticos no cérebro de camundongos adultos[11].

Esses avanços levaram a um uso generalizado de mutagênese condicional em pesquisa biomédica, afetando diversas disciplinas, se tornando uma poderosa ferramenta para determinar função gênica em tipos celulares específicos e em momentos específicos do desenvolvimento.

Componentes[editar | editar código-fonte]

Cre recombinase[editar | editar código-fonte]

A proteína Cre (assim nomeada pela abreviação de "causes recombination" ou "cyclization recombinase")[12][13] tem 343 aminoácidos e consiste de 4 subunidades e dois domínios: um domínio C-terminal maior e um N-terminal menor. O domínio C-terminal tem estrutura similar a domínios na família de integrases isolada de bacteriófago λ, e também é o sítio catalítico dessa enzima[14].

Sítios LoxP[editar | editar código-fonte]

Esquema de algumas possibilidades de recombinação da Cre recombinase, de acordo com a direcionalidade dos sítios Lox.

Os sítios loxP são sequências de 34 pb, consistindo de duas sequências simétricas de 13 pb flanqueando uma sequência simétrica de 8 pb, portando sendo dotados de direcionalidade, o que define como a enzima irá modificar a sequência. A recombinação pode ocorrer tanto in cis como in trans, o que abre também possibilidades de troca de sequências ou integração com plasmídeos.

Para alguns usos é necessário fazer múltiplas recombinações no mesmo organismo em sítios diferentes. Para isso são usados sítios loxP alternativos, que possuem sua sequência central modificada[15]. A Cre recombinase irá interagir ao mesmo tempo apenas com sítios com sequências assimétricas iguais, criando a possibilidade de um sistema com recombinações múltiplas que não interferem umas nas outras (ortogonais).

Exemplos de sítios loxP alternativos
Nome Região simétrica de 13pb Região assimétrica de 8pb Região simétrica de 13pb
Selvagem ATAACTTCGTATA ATGTATGC TATACGAAGTTAT
lox 511 ATAACTTCGTATA ATGTATaC TATACGAAGTTAT
lox 5171 ATAACTTCGTATA ATGTgTaC TATACGAAGTTAT
lox 2272 ATAACTTCGTATA AaGTATcC TATACGAAGTTAT
M2 ATAACTTCGTATA AgaaAcca TATACGAAGTTAT
M3 ATAACTTCGTATA taaTACCA TATACGAAGTTAT
M7 ATAACTTCGTATA AgaTAGAA TATACGAAGTTAT
M11 ATAACTTCGTATA AGATAGAA TATACGAAGTTAT
lox 71 TACCGTTCGTATA NNNTANNN TATACGAAGTTAT
lox 66 ATAACTTCGTATA NNNTANNN TATACGAACGGTA

Mecanismo[editar | editar código-fonte]

Um esquema do mecanismo de ação da Cre recombinase ao juntar sítios Lox66 e Lox71 de plasmídeos diferentes em um único plasmídeo contíguo.

A Cre recombinase atua nos sítios loxP ligando-se nas regiões simétricas nas bordas dos sítios, formando um dímero. O corte da fita de DNA será feito de acordo com sua direcionalidade, definida pela sequência assimétrica no meio desse sítio[16]. Esse dímero irá então se associar a outro dímero de Cre recombinase, formando um tetrâmero, promovendo o corte de uma das fitas de DNA e, junto à ação de DNA ligase, a criação de um intermediário de junção de Holliday[17]. As fitas simples geradas podem então ser alongadas por uma DNA polimerase para terminar o rearranjo das sequências, gerando deleções, inversões e translocações.

Animais Nocaute[editar | editar código-fonte]

Um esquema de experimento com utilização de recombinação Cre-Lox. O gene alvo e o códon de parada são removidos na prole do cruzamento por esta expressar Cre recombinase em suas células. Como resultado, as células com Cre recombinase expressa não irão expressar o gene alvo e expressar proteína verde fluorescente.

Muitos fatores durante o desenvolvimento podem exibir funções múltiplas em locais diferentes do organismo, ou em momentos diferentes da ontogenia, dependendo do contexto em que se encontra. É possível portanto que a criação de um animal nocaute para alguma função específica seja inviável, se o que exerce essa função tem papel vital em outro momento da ontogenia ou em outro órgão ou tecido corporal. Por isso se dá a importância de uma tecnologia capaz de fazer deleções tecido-específicas em momentos específicos, dependendo de um input externo.

Normalmente são feitos animais nocaute pelo cruzamento de linhagens de animais modificadas, uma com a alteração em questão, a sequência floxed, e outra com expressão de Cre recombinase.  É possível fazer deleção condicional através do uso de uma recombinase expressa por um promotor condicional ou com ação tecido-específica[18]. Deste modo apenas aquelas células que conseguirem ativar o promotor irão ter a sequência floxed modificada.

Outra forma de controle espacial da deleção é a injeção de Cre recombinase viral manualmente através de vetores de adenovírus ou lentivírus, tornando a expressão de Cre tão específica quanto a capacidade de isolar áreas a serem infectadas com vetores virais[19].

O controle temporal de expressão de Cre é mais utilizado com dois sistemas: indução por tetraciclina ou por tamoxifeno. O controle por teraciclina advém do mecanismo bacteriano de resistência a tetraciclina, composto pela proteína tetR e a sequência de DNA operador tetO. O sistema pode ser arranjado para levar à expressão de Cre na ausência ou presença de tetraciclina ou doxiciclina (Tet-Off e Tet-On, respectivamente). O sistema indutível por tamoxifeno funciona à base da fusão da Cre recombinase a um domínio do receptor de estrogênio humano, que na ausência de tamoxifeno impede a entrada da enzima no núcleo da célula, impedindo recombinação. As alterações pela recombinase podem então ser controladas temporalmente de acordo com a administração de tamoxifeno. É importante ressaltar que estes sistemas podem apresentar expressão basal de Cre dependendo do contexto celular e levar a deleções não intencionais, podendo levar a problemas de viabilidade embrionária.

Referências

  1. Van Duyne, Gregory D. (5 de fevereiro de 2015). «Cre Recombinase». Microbiology Spectrum (em inglês). 3 (1). ISSN 2165-0497. doi:10.1128/microbiolspec.mdna3-0014-2014 
  2. Abremski, Kenneth; Hoess, Ronald. «Phage P1 Cre-loxP site-specific recombination». Journal of Molecular Biology. 184 (2): 211–220. doi:10.1016/0022-2836(85)90374-2 
  3. Sauer, Brian. «Inducible Gene Targeting in Mice Using the Cre/loxSystem». Methods. 14 (4): 381–392. doi:10.1006/meth.1998.0593 
  4. Sauer, B. (1 de junho de 1987). «Functional expression of the cre-lox site-specific recombination system in the yeast Saccharomyces cerevisiae.». Molecular and Cellular Biology (em inglês). 7 (6): 2087–2096. ISSN 0270-7306. PMID 3037344. doi:10.1128/mcb.7.6.2087 
  5. Sauer, B.; Henderson, N. (1 de julho de 1988). «Site-specific DNA recombination in mammalian cells by the Cre recombinase of bacteriophage P1». Proceedings of the National Academy of Sciences. 85 (14): 5166–5170. doi:10.1073/pnas.85.14.5166 
  6. Sauer, B.; Henderson, N. (1 de julho de 1988). «Site-specific DNA recombination in mammalian cells by the Cre recombinase of bacteriophage P1». Proceedings of the National Academy of Sciences. 85 (14): 5166–5170. doi:10.1073/pnas.85.14.5166 
  7. Gu, Hua; Zou, Yong-Rui; Rajewsky, Klaus. «Independent control of immunoglobulin switch recombination at individual switch regions evidenced through Cre-loxP-mediated gene targeting». Cell. 73 (6): 1155–1164. doi:10.1016/0092-8674(93)90644-6 
  8. Gu, H.; Marth, J. D.; Orban, P. C.; Mossmann, H.; Rajewsky, K. (1 de julho de 1994). «Deletion of a DNA polymerase beta gene segment in T cells using cell type-specific gene targeting». Science (em inglês). 265 (5168): 103–106. ISSN 0036-8075. PMID 8016642. doi:10.1126/science.8016642 
  9. Hennet, T.; Hagen, F. K.; Tabak, L. A.; Marth, J. D. (19 de dezembro de 1995). «T-cell-specific deletion of a polypeptide N-acetylgalactosaminyl-transferase gene by site-directed recombination». Proceedings of the National Academy of Sciences. 92 (26): 12070–12074. doi:10.1073/pnas.92.26.12070 
  10. Tsien, Joe Z. (2016). «Cre-Lox Neurogenetics: 20 Years of Versatile Applications in Brain Research and Counting…». Frontiers in Genetics (em English). 7. ISSN 1664-8021. doi:10.3389/fgene.2016.00019 
  11. Tsien, Joe Z; Chen, Dong Feng; Gerber, David; Tom, Cindy; Mercer, Eric H; Anderson, David J; Mayford, Mark; Kandel, Eric R; Tonegawa, Susumu. «Subregion- and Cell Type–Restricted Gene Knockout in Mouse Brain». Cell. 87 (7): 1317–1326. doi:10.1016/s0092-8674(00)81826-7 
  12. «cyclization recombinase [Escherichia coli] - Protein - NCBI». www.ncbi.nlm.nih.gov. Consultado em 16 de abril de 2018 
  13. Sternberg, Nat; Hamilton, Daniel. «Bacteriophage P1 site-specific recombination». Journal of Molecular Biology. 150 (4): 467–486. doi:10.1016/0022-2836(81)90375-2 
  14. «cre - Recombinase cre - Escherichia phage P1 - cre gene & protein». www.uniprot.org (em inglês). Consultado em 16 de abril de 2018 
  15. Missirlis, Perseus I.; Smailus, Duane E.; Holt, Robert A. (4 de abril de 2006). «A high-throughput screen identifying sequence and promiscuity characteristics of the loxP spacer region in Cre-mediated recombination». BMC Genomics. 7. 73 páginas. ISSN 1471-2164. doi:10.1186/1471-2164-7-73 
  16. Lee, Linda; Sadowski, Paul D. «Sequence of the loxP Site Determines the Order of Strand Exchange by the Cre Recombinase». Journal of Molecular Biology. 326 (2): 397–412. doi:10.1016/s0022-2836(02)01429-8 
  17. Gopaul, Deshmukh N.; Guo, Feng; Duyne, Gregory D. Van (15 de julho de 1998). «Structure of the Holliday junction intermediate in Cre–loxP site‐specific recombination». The EMBO Journal (em inglês). 17 (14): 4175–4187. ISSN 0261-4189. PMID 9670032. doi:10.1093/emboj/17.14.4175 
  18. Utomo, Ahmad R.H.; Nikitin, Alexander Yu.; Lee, Wen-Hwa (1999/11). «Temporal, spatial and cell type–specific control of Cre-mediated DNA recombination in transgenic mice». Nature Biotechnology (em inglês). 17 (11): 1091–1096. ISSN 1546-1696. doi:10.1038/15073  Verifique data em: |data= (ajuda)
  19. Walrath, Jessica C.; Hawes, Jessica J.; Dyke, Terry Van; Reilly, Karlyne M. «Genetically Engineered Mouse Models in Cancer Research»: 113–164. doi:10.1016/s0065-230x(10)06004-5