Transferência ressonante de energia por fluorescência

Origem: Wikipédia, a enciclopédia livre.
Saltar para a navegação Saltar para a pesquisa
Ambox important.svg
Foram assinalados vários aspectos a serem melhorados nesta página ou se(c)ção:
Mecanismo do FRET

Denomina-se de Transferência de energia por ressonância de Förster (FRET), ou transferência de energia de ressonância por fluorescência (FRET), ou transferência de energia por ressonância (RET) o mecanismo de transferência de energia de forma não-radiativa entre dois cromóforos, sem a necessidade de reabsorção de radiação eletromagnética.[1] De maneira geral um cromóforo doador, inicialmente no seu estado eletrônico excitado, pode transferir energia para um aceitador, outro cromóforo, através do acoplamento dipolo-dipolo não radiativo.[2] A eficiência desta transferência de energia é inversamente proporcional à sexta potência da distância entre o doador e o aceitador por esse mecanismo, tornando extremamente sensível a pequenas distâncias, da ordem de 1 a 10 nm.[3]

As medições da eficiência do mecanismo Transferência Ressonante de Energia por fluorescência pode ser usado para determinar se dois fluoróforos estão a uma certa distância um do outro. Tais medições são utilizadas como uma ferramenta útil de pesquisa para quantificar a dinâmica molecular em biofísica e bioquímica, tais como interações proteína-proteína, interações DNA-proteína, ou mudanças conformacionais de proteínas.[4]

Mecanismo[editar | editar código-fonte]

A fluorescência é o mecanismo o qual uma molécula ou um grupo eletronicamente excitado emite luz. O fóton é emitido após o decaimento do estado inicial excitado a de um estado excitado de menor energia. Assim, o espectro de emissão da molécula é geralmente de comprimento superior ao absorvido. O mecanismo de FRET é análogo à comunicação entre campos próximos, em que o raio de interação é muito menor do que o comprimento de onda da luz emitida. Na região de campo próximo, o cromóforo excitado emite um fóton virtual que é instantaneamente absorvido pelo cromóforo de recepção. Estes fótons virtuais são indetectáveis​​, já que sua existência viola a conservação de energia e momento, e, portanto, FRET é conhecido como um mecanismo não radioativo de transferência.

Princípios teóricos[editar | editar código-fonte]

A eficiência do FRET () é medida através do rendimento quântico de fluorescência na transferência de energia, ou seja, a fração de eventos de transferência de energia que ocorrem por excitação doador:

onde é a taxa de transferência de energia, a taxa de decaimento radioativo, e são as constantes de velocidade de quaisquer outras vias de excitação.

É a distância, , entre o par de doador e aceitador na qual a eficiencia da transferência é igual a 50% e recebe o nome de Raio de Förster.[5]

A eficiência do mecanismo de FRET depende de parâmetros físicos como a distância entre o doador e o aceitador, as sobreposições espectrais do espectro de emissão do doador e do espectro de absorção de aceitador, bem como da orientação relativa do momento de dipolo de emissão do doador e do aceitador no momento da transferência e, por fim da distancia de separação do doador-aceitador, com uma lei de potência inversa 6, devido ao mecanismo de ligação dipolo-dipolo.

Rendimento quântico[editar | editar código-fonte]

O rendimento quântico de fluorescência () é definido:

Tempo de vida[editar | editar código-fonte]

A eficácia da transferência de energia por fluorescência pode também ser determinada a partir da alteração no tempo de vida de fluorescência do dador. O tempo de vida do doador irá diminuir na presença do aceitador. Medições de tempo de vida do FRET são usados ​​em microscopia de fluorescência.

Fator de orientação[editar | editar código-fonte]

O factor de orientação (k²) é 2/3 em meios que reorienta rapidamente (por exemplo, moleculas livres em uma solução de baixa viscosidade), mas pode situar-se entre 0 e 4, dependendo das condições.

Nomenclatura[editar | editar código-fonte]

A terminologia do FRET para transferência ressonante de energia de Förster é nomeado em homenagem ao cientista alemão Theodor Förster. Quando ambos os cromóforos são fluorescentes, o termo "transferência de energia de ressonância de fluorescência" é frequentemente usado em vez disso, embora a energia não é realmente transferido por fluorescência. A fim de evitar uma interpretação errônea do fenômeno que é sempre uma transferência não radiativa de energia (mesmo quando ocorre entre dois cromóforos fluorescentes), o nome de "transferência de energia ressonância Förster" é preferível a "transferência de energia de ressonância de fluorescência," no entanto, este último goza de uso comum na literatura científica.

Aplicações[editar | editar código-fonte]

A transferência de energia de Föster tem sido utilizado para medir a distância e detectar interações moleculares em vários sistemas e tem aplicações em biologia e da química. A eficiência do mecanismo de FRET depende de parâmetros físicos como a distância entre um grupo fluorescente doador e o aceptor, em proteínas as cadeias laterais dos resíduos de triptofano e tirosina podem ser grupos fluorescentes em proteínas. Quando a molécula fluorescente doadora é excitada eletronicamente parte da sua energia de excitação é transferida para a molécula aceptora. Após essa transferência a intensidade da fluorescência emitida pelo aceptor no seu espectro de emissão pode ser detectada. Além disso, pela técnica de mutagênese sítio-dirigida, substituição de resíduos, é possível localizar e quantificar o número desses resíduos. As cisteínas, por possuírem cadeias reativas, podem ser ligadas covalentemente a grupos fluorescentes ou serem localizadas por mutagênese sítio-dirigida[6]. A técnica de FRET também pode ser utilizada para avaliação da atividade proteásica. Aceptores e doadores são acoplados a extremidades opostas de um peptídeo que contem o sítio de clivagem proteolítico. Após a clivagem pela atividade enzimática é possível detectar o afastamento entre as espécies, e o sinal de fluorescência proveniente do doador é aumentado. O FRET pode ser utilizado para a detecção da variação da distância entre resíduos protéicos específicos com o tempo para a avaliação da estrutura, dobramento, distribuição espacial e montagem de proteínas[7]. Aplicações em sistemas vivos como células vivas, o FRET tem sido utilizado para detectar a localização e as interações dos genes e das estruturas celulares, incluindo integrinas e proteínas de membranas. O FRET pode ser usado para obter informação sobre as vias metabólicas ou de sinalização. Também é utilizado para estudar jangadas lipídicas em membranas celulares.

Considerações[editar | editar código-fonte]

As abordagens baseadas em imagem por FRET têm contribuído bastante para a ciência, porém a técnica requer alguns cuidados especiais:

  1. O desenho experimental deve levar em conta se a distância entre as espécies irá aumentar ou diminuir, assim alterando o sinal detectado;
  2. Para que ocorra a transferência energética o doador e aceptor devem apresentar sobreposição no espectro de absorção e emissão de energia;
  3. Para que as fluorescências emitidas sejam diferenciadas entre o aceptor e o doador os espectros de emissão devem ser distintos;
  4. A excitação direta do aceptor deve ser minimizada de acordo com a escolha do comprimento de onda de excitação do doador selecionado[7].

Ver também[editar | editar código-fonte]

Referências

  1. Gilbert, A.: Baggott, J.: Essentials of Molecular Photochemistry, Blackwell Scientific Publications: Oxford, 1991.
  2. Lakowicz, Joseph R, Principles of fluorescence spectroscopy, 3ª edição, Springer, 2009.
  3. Birks, J. B.; Photophysics of Aromatic Molecules, John Wiley & Sons Ltd.: New York, 1970.
  4. Valeur, Bernard and others; Molecular fluorescence: principles and applications, John Wiley & Sons Ltd.: John Wiley \& Sons, 2013.
  5. Förster, Th. (1965). «Delocalized Excitation and Excitation Transfer». In: Sinanoglu, Oktay. Modern Quantum Chemistry. Istanbul Lectures. Part III: Action of Light and Organic Crystals. 3. New York and London: Academic Press. pp. 93–137. Consultado em 22 de junho de 2011. 
  6. VOET, Donald; VOET, Judith. Bioquímica. Porto Alegre: Artmed, 2013.
  7. a b FRET (FLUORESCENCE RESONANCE ENERGY TRANSFER) E BRET (BIOLUMINESCENT RESONANCE ENERGY TRANSFER) COMO FERRAMENTAS PARA ESTUDO DA BIOLOGIA DE GPCRS (G-PROTEIN COUPLED RECEPTORS), Edition: 01, Chapter: 11, Publisher: Blucher,, Editors: Rodrigo Ribeiro Resende e Carlos Ricardo Soccol, pp.315-342

Ligações externas[editar | editar código-fonte]

Ícone de esboço Este artigo sobre Química é um esboço. Você pode ajudar a Wikipédia expandindo-o.