Usuário(a):Rafael Kenneth/Testes2

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Cromatógrafo líquido de alta eficiência moderno.

A cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE; em inglês: High performance liquid chromatography, HPLC) é um método de separação de compostos químicos em solução, a qual é utilizada na química analítica para identificar e quantificar cada componente de uma mistura. Esta técnica consiste no bombeamento de um solvente líquido pressurizado contendo uma mistura que passa através de uma coluna preenchida com algum material sorvente. Cada componente da amostra interage de forma diferenciada com o material sorvente, gerando diferentes velocidades para cada componente e levando à separação conforme eles percorrem a coluna.

A cromatografia líquida foi definida no início de 1900 pelo botânico russo Mikhail S. Tswett. Considerado o pai da cromatografia, Tswett publicou o primeiro artigo de cromatografia líquida, no qual ele descreveu a separação de compostos (pigmentos de folhas) extraídos de plantas, utilizando solvente em uma coluna empacotada com partículas de carbonato de cálcio. No período entre 1906 e 1952 houve alguns avanços importantes, como por exemplo o surgimento da técnica de cromatografia planar, onde um papel é usado como suporte. No entanto, em 1950 foi introduzido como alternativa a camada fina de sílica, que posteriormente ficou conhecida como cromatografia de camada delgada (CCD). O avanço da cromatografia em coluna foi por volta de 1940 com Martin e Synge, vencedores do prêmio Nobel, descreveram um modelo para a cromatografia líquida-líquida (ou de partição). A cromatografia líquida moderna foi desenvolvida a partir de 1970, se diferenciando da cromatografia em coluna (atualmente denominada cromatografia líquida clássica) e se aperfeiçoando até chegar no que atualmente é conhecido como cromatografia líquida de alta eficiência.

A CLAE é capaz de separar uma grande quantidade de compostos em diversos tipos de amostra no espaço de tempo de alguns minutos, exibindo alta resolução e detectabilidade.

Aspectos gerais

Ver artigo principal: Cromatografia

A cromatografia consiste em um método físico-químico para a separação de misturas, nos quais os componentes se distribuem em duas fases que permanecem em contato íntimo. Uma das fases é fixa sob um suporte (fase estacionária), e uma fase móvel passa através dela. Durante o processo, os componentes são separados devido às diferentes interações que estes exibem com a fase estacionária. Este procedimento também é chamado de eluição, a fase móvel ao entrar na coluna é chamada de eluente e a fase móvel contendo os componentes ao sair da coluna é denominado eluato. Um cromatograma é obtido na análise e constituí um gráfico da intensidade do sinal gerado pela substância no detector em função do tempo que decorreu da partida até a chegada ao detector.

Representação esquemática simplificada de um instrumento de CLAE.

A configuração básica de um cromatógrafo líquido de alta eficiência possui um reservatório contendo a fase móvel a ser eluída, a qual é succionada por uma bomba de alta pressão. A amostra é injetada por meio de uma seringa e encontra a fase móvel, que percorre a coluna contendo a fase estacionária. Ao sair da coluna, um detector capaz de medir alguma propriedade físico-química registra a informação que é convertida em dados passíveis de serem lidos num sistema de dados. O conteúdo que eluiu da coluna é armazenado em algum recipiente. A imagem ao lado é um diagrama representando estas etapas. Os cromatógrafos a líquido são comercializados como sistema modular ou unidade integrada. Um sistema modular permite que cada componente trabalhe de forma independente e facilita a manutenção do equipamento, enquanto que uma unidade integrada é mais compacta e têm seu desempenho otimizado.

A CLAE pode ser classificada de acordo com o diâmetro interno da coluna em: preparativa (6-50 mm), analítica (2-6 mm), com microdiâmetro (1-2 mm) e capilares (<1 mm). A fase estacionária pode estar na forma sólida ou líquida, podendo esta última estar apenas espalhada ou imobilizada sobre o suporte. A imobilização do líquido pode envolver ligações químicas com o suporte, ou, somente entre as próprias cadeias do líquido; neste caso chama-se de cromatografia com fase ligada. A polaridade relativa das fases é outro item importante. Quando é empregada uma fase estacionária mais polar do que a fase móvel, denomina-se de cromatografia líquida com fase normal; do contrário se chama de fase reversa.

Na imagem abaixo têm se uma representação mais detalhada do instrumento, contendo os seguintes componentes:

1. Reservatório de solventes: local onde se coloca o solvente ou a mistura de solventes a ser usada como fase móvel;
2. Desgaseificador de solventes (opcional): utiliza-se para garantir a qualidade da fase móvel removendo gases dissolvidos, quando necessário;
3. Válvula de gradiente;
4. Câmara de mistura da fase móvel;
5. Bomba de alta pressão: gera um fluxo constante e reprodutível da fase móvel para a coluna;
6. Válvula na posição de injeção; 6'. Válvula na posição de carregamento;
7. Alça de amostragem;
8. Pré-coluna;
9. Coluna;
10. Detector;
11. Aquisição de dados;
12. Coletor de resíduo.

Esquema detalhado dos componentes de um cromatógrafo líquido de alta eficiência.

História e desenvolvimento

O botânico russo Mikhail Tswett foi o primeiro a estabeler um estudo sistemático em 1903 do que na atualidade se conhece por cromatografia, embora já houvesse alguns trabalhos utilizando de algum princípio da cromatografia. Ele utilizou uma coluna de vidro recheada com um adsorvente sólido que serviu como fase estacionária e um líquido como fase móvel. As amostras utilizadas eram extratos de clorofila dissolvidas em éter de petróleo; mais de cem materiais adsorventes foram utilizados, entre os quais se destacam sílica, alumina, carvão vegetal, carbonato de cálcio, óxido de magnésio e sacarose. Tswett ainda identificou as diferentes frações obtidas utilizando espectrofotometria em diveros comprimentos de onda, antecipando um dos detectores mais comuns em cromatografia líquida. O nome cromatografia foi cunhado por ele próprio, cujas raízes gregas são chroma e graphein, significando cor e escrita, respectivamente. Desse modo, a "escrita das cores" refere-se às bandas coloridas formadas na coluna devido aos pigmentos. Embora a análise visual seja uma forma de detecção, a cromatografia não se restringe a compostos coloridos, o que havia sido reconhecido por Tswett em seu artigo de 1906. Alguns autores especulam que Tswett, cujo sobrenome em russo também significa a palavra "cor", poderia ter utilizado de seu senso de humor para denominar a técnica como "escrita de Tswett".

A partir de 1913, o pesquisador americano Leroy Sheldon Palmer (1887-1944) publicou uma série de artigos descrevendo o uso da cromatografia líquida de coluna para a separação de pigmentos em plantas e lacticínios, que culminou em um livro publicado em 1922 sobre as suas pesquisas no qual os esforços de Tswett foram reconhecidos. Um dos principais motivos pelo desinteresse da comunidade científica na área de cromatografia se deu devido à ênfase em processos de larga escala na química orgânica sintética no início do século XX, enquanto que o método de separação possuía uma escala de tamanho relativamente pequena.

Em 1930, na Alemanha, Edgar Lederer utilizou os estudos de Tswett e Palmer para investigar pigmentos em gema de ovo. Devido à relativa rapidez do método empregado foi possível evitar a degradação de moléculas de caroteno. A partir de então, outras formas além da cromatografia líquida de coluna puderam ser desenvolvidas, bem como outros métodos de análise instrumental tais como espectroscopia de infravermelho e espectrometria de massas, que viria mais tarde a ser incorporada à própria cromatografia.

Richard Synge era um estudante ativo no laboratório de bioquímica da Universidade de Cambridge quando, em 1938, lhe foi ofertado uma bolsa de estudos para examinar a composição de aminoácidos presentes na lã, bem como melhorar os métodos de análise química da lã, ainda pouco desenvolvidos. Synge procurou Archer Martin, que possuía extenso conhecimento sobre processos de extração, com quem elaborou uma sólida parceria por cinco anos. Eles foram trabalhar nos laboratórios da Associação de Pesquisa de Indústrias de Lã na cidade britânica de Leeds. Após diversas tentativas, construíram um aparato constituído de uma coluna empacotada com silica gel impregnada com água. A mistura de aminoácidos fora colocada no topo e eluída com clorofórmio. Alaranjado de metila foi utilizado como indicador visual, que permitiu a visualização dos aminoácidos percorrendo a coluna e formando bandas vermelhas. No primeiro experimento, eles separaram acetil-prolina e acetil-leucina e coletaram as respectivas frações. As principais dificuldades estavam associadas com o preparo das fases estacionária e móvel, utilização do indicador e coleta das frações. Martin também desenvolveu uma teoria a partir do conceito de pratos teóricos da destilação fracionada. Em 1941, eles publicaram um artigo dividido em duas partes no Biochemical Journal sobre o trabalho desenvolvido. Esta foi a maior contribuição para o desenvolvimento da cromatografia moderna, capaz de predizer muitos dos desenvolvimentos em cromatografia que mais tarde viriam a ser confirmados. Martin e Synge foram agraciados com o Prêmio Nobel de Química em 1952 pela "invenção da cromatografia de partição". Martin e colaboradores conseguiram também conduzir a separação utilizando celulose (cromatografia em papel) em 1943.

Um químico em meados da década de 1950 utilizando cromatografia em coluna.

Em 1952, Martin e o colaborador James conseguiram pôr em prática a cromatografia gás-líquido, na qual compostos voláteis são analisados com uma fase móvel gasosa e a fase estacionária sendo um líquido imobilizado em um suporte sólido. Se por um lado a química se desnvolveu conforme as técnicas analíticas avançaram, por outro estes avanços só foram possíveis graças a uma necessidade militar ou econômica. Naquela época, havia uma necessidade da indústria do petróleo que estava rapidamente se expandindo conforme demandas de uma era pós guerra com o uso em larga escala de motores para transporte.

A indústria do petróleo foi essencial no aprimoramento da cromatografia gasosa, permitindo analisar misturas complexas de hidrocarbonetos em questão de uma hora, o que não era possível com o equipamento disponível em cromatografia líquida que se encontrava na era de Tswett. A partir de meados da década de 1960 as limitações que envolviam a cromatografia gasosa se tornaram evidentes. Com o crescimento das indústrias farmacêuticas e agroquímicas, surgiu a necessidade de utilizar das técnicas cromatográficas para compostos não voláteis e termicamente instáveis sem precisar de uma etapa de derivatização.

A cromatografia em camada delgada (CCD) foi introduzida em 1956 por Egon Stahl. O adsorvente da fase estacionária era misturada com uma substância aglutinante e permitia a fixação da camada ao prato de vidro, o que permitiu a fase estacionária na posição vertical e o processo de eluição ocorrendo por capilaridade. Apesar de ser compatível com compostos não voláteis, o processo de quantificação ou mesmo de separação não era tão eficiente. No final da década de 1960 as pesquisas foram sendo conduzidas no sentido de fazer a cromatografia gasosa mais aplicável aos compostos não voláteis pelo uso de fluido supercrítico, uma vez que o poder de solvatação deste é maior quando comparado com um gás. No entanto, a técnica não avançou devido às dificuldades intrínsecas que não permitiram um modelo de instrumento disponível comercialmente. O desenvolvimento da cromatografia líquida de alta eficiência foi o caminho mais rápido encontrado para a análise de compostos não voláteis.

O avanço tecnológico permitiu a aplicação da teoria cromatográfica em cromatografia líquida de coluna, confirmando as previsões de Martin e Synge. O destaque destas mudanças é o uso de partículas menores na fase estacionária sólida, que é acompanhada da inserção de uma bomba para forçar a passagem da fase móvel. A técnica melhorada recebeu as denominações de "alta velocidade" e de "alta pressão". Estes termos foram substituídos por "alta eficiência" devido a alta capacidade de separação, detecção, quantificação e rapidez. O sistema de detecção visual com um indicador colorimétrico deixou de ser utilizado e a escala de tamanho foi reduzida visando atender análises quantitativas ao invés de procedimentos preparativos.

**********ESBOÇO
A CLAE se mostrou uma técnica muito melhor do que a cromatografia gasosa, em especial na análise de fármacos, agroquímicos e outras substâncias não voláteis de grande importância comercial da época. Como resultado, a técnica passou por um vertiginoso desenvolvimento. Pioneiros deste campo foram Huber, Kirkland, Knox, Snyder, Scott e Horváth. Partindo de um ponto de vista teórico, muitos avanços tecnológicos foram alcançados em um curto espaço de tempo. Notavelmente durante a década de 1970, o problema fundamental de reduzir o alargamento de bandas dos analitos foi abordado com a mudança de partículas peliculares de 40 μm - partículas que consistem de um núcleo não poroso coberto com uma fina camada de cerca de 5 μm - para partículas totalmente porosas de 10 μm, partículas com formatos irregulares e então particulas totalmente porosas de 5 μm, particulas esféricas com uma distribuição de tamanhos pouco variável. Houve um desenvolvimento simultâneo no entendimento das interações entre o solvente e o suporte. Melhores resolving powers puderam ser obtidos dessa forma na análise de como as variáveis experimentais influenciam a separação e otimizando-as. A exploração dos aprimoramentos em seletividade para melhorar a resolução cromatográfica se extenderam à introdução de diferentes modos de CLAE que geraram um amplo intervalo de tipos de equilíbrio químico que podem ser usados como veículos para se atingir a separação (mecanismos). Os fabricantes de intrumentação tiveram um papel importante também. Houveram muitos destaques nas bombas, injetores e detectores que tiveram de ser incorporados, mas com principal foco no desenvolvimento de bombas com fluxo contínuo e livre de pulsação, injetores para pequenas quantidades (cerca de 20 μL) repetidamente em altas pressões e detectores que fornecessem um bom sinal por unidade de concentração do analito contra um baixo ruído.
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Mecanismos de separação cromatográfica

Ficheiro:Absorption vs adsorption.svg
Ficheiro:Silanol.svg

Adsorção (líquido-sólido)

A cromatografia líquido-sólido (CLS) ou por adsorção é caracterizada pela disputa das moléculas da amostra e da fase móvel por sítios ativos na superfície da fase estacionária, um princípio que já tinha sido consolidado na cromatografia líquida clássica e de camada delgada. A adsorção é a formação de uma interação entre uma molécula (adsorvato) com um sítio ativo na superfície de um material adsorvente. O adsorvente mais importante neste método cromatográfico é a sílica, nos quais os sítios ativos são os grupos silanóis presentes. A sílica encontra-se rodeada pela fase móvel e o solvente ocupa todos os sítios ativos disponíveis. Uma molécula da amostra apenas pode ser adsorvida se a interação resultante for mais forte do que quando com o solvente. A interação ocorre entre os grupos silanóis com o grupo funcional mais polar do adsorvato. As separações por CLS são insatisfatórias para distinguir moléculas que possuem os mesmos grupos funcionais com diferenças apenas na cadeia carbônica, tais como hexanol, heptanol e octanol. Além da presença de grupos funcionais, fatores estéricos podem também afetar a força da interação, o que torna uma mistura de isômeros, por exemplo, adequada para a cromatografia de adsorção. Outro adsorvente comumente utilizado é a alumina.

Partição (líquido-líquido)

A cromatografia líquido-líquido (CLL) ou de partição se baseia nas diferentes solubilidades que os componentes da amostra possuem na fase móvel e na fase estacionária. Os componentes que possuem maior solubilidade na fase estacionária possuem uma maior retenção, enquanto que os componentes que se mostram mais solúveis na fase móvel são eluídos mais rapidamente. A maior dificuldade associada com esta técnica é a solubilidade da fase estacionária na fase móvel, o que leva à deterioração da coluna.

Fase ligada

A cromatografia de fase ligada (CFL) surge para resolver os problemas associados à CLL devido à perda da fase estacionária, sendo a fase estacionária um líquido imobilizado ou quimicamente ligado à superfície de um suporte. Em muitas situações, pode ser vista como um modelo de partição, porém, pode apresentar a influência de grupos polares presentes na fase estacionária ou da superfície do suporte, exibindo também um mecanismo de adsorção. Por isto, é considerado um mecanismo à parte dos demais.

CROMATOGRAFIA DE PAR IÔNICO

Troca iônica

A cromatografia de troca iônica passou a ser utilizada na separação de aminoácidos a partir de 1965. As separações eram dispendiosas e, para misturas biológicas complexas, poderiam levar vários dias para se obter o resultado. Surge, desta forma, uma necessidade de se avançar instrumentalmente, por meio de sistemas mais automatizados e otimizados, culminando na CLAE moderna. O princípio de troca iônica se assemelha à adsorção, porém a fase estacionária apresenta cargas elétricas em sua superfície. Grupos tais como sulfonatos (—SO₃⁻), carboxilatos (—COO⁻), amônio primário (—NH₃⁺) ou amônio quaternário (—NR₃⁺) são incorporados à resina ou gel. Essas cargas são neutralizadas por contra-íons presentes na fase móvel ou por moléculas carregadas provenientes da amostra que competem por uma posição na superfície da fase estacionária.

Fases móveis

Preparação e armazenamento

A presença de material particulado no sistema cromatográfico pode gerar vazamentos e resultar num fluxo inadequado. Esse problema pode ser visualizado na queda da sensibilidade, flutuações no controle de pressão da bomba e variações de tempo de retenção. Idealmente, a abordagem para esta situação requeria o uso de filtros com diâmetros de 0,45 μm, embora a maior parte das bombas modernas utilizem filtros de maior porosidade. O processo de filtração da fase móvel possui algumas inconveniências como o custo e o tempo, bem como da possibilidade de contaminação. Em alguns casos, pode ser viável à compra desses solventes já filtrados para finalidade de uso como fase móvel.

Os eluentes de CLAE usualmente passam por processos de desgaseificação antes de seu uso, especialmente no caso de solventes polares que conseguem dissolver quantidades significativas de ar, como por exemplo a água, soluções tampão, misturas aquosas e solventes orgânicos miscíveis com água. Problemas que podem ocorrer pela presença de bolhas de gases incluem a queda de detectabilidade e sensibilidade do detector pela presença de ruídos e picos extras.

O processo de desgaseificação pode ser feito com a aplicação de banho de ultrassom com ou sem vácuo. No caso da cromatografia por par iônico, a presença de agentes tensoativos podem formar espumas, e seu uso é desaconselhado. Um desgaseificador no próprio instrumento é mais eficiente — embora mais caro — e pode ser de duas maneiras: pela aplicação de um fluxo de gás hélio no reservatório que retém os demais gases, porém como o hélio possui uma baixa solubilidade no eluente, este acaba levando os gases para fora; e pela utilização de um módulo desgaseificador, no qual a fase móvel passa por uma membrana permeável de Teflon e os gases são eliminados por vácuo.

Bombas de alta pressão

As bombas de alta pressão são responsáveis pelo fluxo de fase móvel que precisa percorrer a coluna, vencendo a resistência oferecida pelas partículas do material empacotado. As pressões empregadas variam de 0,1 a 350 bar, permitindo uma vazão constante e sem pulsos (ou com sistema de amortecimento). O fluxo aplicado dependerá do tipo de coluna; em colunas microbore e capilar é de 0,05 a 200 μL/min; em colunas analíticas varia de 10 a 5 000 μL/min, e nas colunas preparativas chega até 100 000 μL/min. A bomba de um cromatógrafo líquido pode ser mecânica (recíproca ou seringa) ou pneumática.

Bombas mecânicas

Animação simplificada de uma bomba recíproca de pistão único. O eluente entra por um canal (1) até a válvula unidirecional de entrada (3), cuja passagem é permitida quando o pistão (5) se move e suga o eluente. No processo de esvaziamento da câmara, a válvula unidirecional de saída (4) se abre enquanto a outra se fecha, o eluente é então enviado para a coluna por meio de um canal de saída (2).

Bombas recíprocas

Uma bomba recíproca possui geralmente um pistão (por vezes, um diafragma) capaz de mover o fluido para o interior de uma pequena câmara de 35 a 400 μL com o auxílio de válvulas unidirecionais que alternadamente se abrem e se fecham; permitindo em seguida que a câmara seja esvaziada. Tais bombas escoam volumes constantes e pulsados de fase móvel. As bombas recíprocas podem se apresentar com um ou dois pistões. As bombas contendo pistão duplo são capazes de reduzir significativamente as pulsações; neste sistema, enquanto um dos pistões realiza a sucção da fase móvel para dentro de uma das cavidades, o outro atua expulsando a fase móvel da outra cavidade. O fluxo gerado pelos dois pistões é encaminhado por uma única tubulação para a coluna cromatográfica.

O pistão é feito de safira ou cerâmica. O acúmulo de solução tampão no interior pode levar à formação de cristais que podem danificar o pistão fazendo com que o fluxo perda precisão. O selo do pistão é feito de algum polímero inerte contendo internamente uma mola com objetivo de resistir às altas pressões da bomba, embora haja um certo grau de vazamento que permite a lubrificação do pistão. Muitas bombas possuem ainda um canal de lavagem para livrar o pistão de sais ou abrasivos que passam pelo selo do pistão. As válvulas são constituídas de bolas de rubi em assentos de safira, materiais resistentes à corrosão. Quando a bola se encontra em seu assento, ela veda a passagem. A presença de material particulado pode causar o não funcionamento adequado dessas válvulas, ocasionando vazamentos. Usualmente, o pistão é acionado por um disco excêntrico.

INSERIR AQUI INFORMAÇÃO SOBRE VANTAGENS E DESVANTAGENS DAS BOMBAS RECÍPROCAS. A maior parte dos cromatógrafos utilizam bombas recíprocas.

Bombas do tipo seringa

Nas bombas do tipo seringa, também conhecidas como bombas de êmbolo ou de deslocamento contínuo, a fase móvel é colocada em um cilindro de volume definido e é deslocada uniformemente para dentro do sistema por meio de um êmbolo ou pistão. O pistão é acionado por um motor com rosca helicoidal que torna a bomba livre de pulsações. Devido ao limite do volume que é passível de ser inserido, é necessário parar momentaneamente a operação para reenchê-la, além de ser incompatível com eluição por gradiente. Estas bombas conseguem gerar altas pressões (até 5 370 bar) e não requerem manutenção frequente. Embora tenham sido amplamente empregadas no início do surgimento da CLAE, as bombas do tipo seringa se tornaram restritas para aplicações utilizando microcolunas e cromatografia de fluído supercrítico. Uma forma mais conveniente pode ser obtida quando duas dessas bombas são combinadas, o que permite um certo grau de gradiente ou uma eluição contínua pelo abastecimento de uma das bombas enquanto a outra permanece em operação.

Limitações e comparações

Tanto a CLAE quanto a cromatografia gasosa (CG) são métodos de alta eficiência devido à separação de diversos componentes muito semelhantes em um relativo curto espaço de tempo. A diferença mais importante entre as duas técnicas é que a cromatografia gasosa requer que as substâncias sejam voláteis e termicamente estáveis em elevadas temperaturas, enquanto que na CLAE a única restrição é a solubilidade na fase móvel. Na CLAE, devido ao estado físico, o coeficiente de difusão é menor e a viscosidade é maior, o que pode se traduzir em um tempo maior de corrida cromatográfica. Por outro lado, a compressibilidade negligenciável de um líquido quando na aplicação de uma elevada pressão permite que a velocidade da fase móvel se mantenha constante em toda a coluna, sendo um fator importante pois garante as mesmas condições de operação em qualquer ponto. Esses são alguns dos fatores que fazem com que as duas técnicas sejam complementares uma a outra, pois geralmente analisam diferentes matrizes.

Bibliografia

Livros

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• Jandera, P.; Henze, G. (2000). Ullmann's encyclopedia of industrial chemistry: Liquid chromatography, 1. fundamentals, history, instrumentation, materials (em inglês). [S.l.]: Wiley-VCH 

• Lough, W. J.; Wainer, I. W. (1995). High performance liquid chromatogrphy : fundamental principles (em inglês). Londres: Blackie Academic & Professional. 276 páginas. ISBN 0751400769 

• Meyer, V. R. (2010). Pratical High-Performance Liquid Chromatography. 5ª ed. [S.l.]: John Wiley & Sons 

• Miller, J. M. (2005). Chromatography: Concepts and contrasts (em inglês) 2 ed. [S.l.: s.n.] 

Artigos

• Martin, A. J. P.; Synge, R. L. M. (1 de dezembro de 1941). «A new form of chromatogram employing two liquid phases» 12 ed. Biochemical Journal (em inglês). 35: 1358-1368. doi:10.1042/bj0351358. Consultado em 19 de novembro de 2018