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Microscópio

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(Redirecionado de Microscópico)
Microscópio
Tipo
Descoberto
Descobridores
Fabricação
Fabricante
microscope maker (d)
Utilização
Usuário(a)s
Uso
Observação de amostras pequenas

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Um microscópio é um instrumento de laboratório usado para examinar objetos pequenos demais para serem vistos a olho nu. A microscopia é a ciência que investiga objetos e estruturas pequenas com o auxílio de um microscópio. Microscópico designa aquilo que não pode ser visto a olho nu sem esse auxílio.

Há muitos tipos de microscópios, que podem ser agrupados de formas diferentes. Uma classificação considera o modo como o instrumento interage com uma amostra e produz imagens, seja fazendo passar ou incidindo um feixe de luz ou elétrons sobre a amostra em seu caminho óptico, detectando emissões de fótons da amostra, ou percorrendo sua superfície a curta distância com uma sonda.[1][2] O tipo mais comum, e o primeiro a ser inventado, é o microscópio óptico, que usa lentes para refratar a luz visível que atravessou uma amostra cortada em seção fina com um micrótomo, ou a luz refletida pela superfície de um objeto, formando uma imagem observável. Outros tipos amplamente usados são o microscópio de fluorescência, o microscópio eletrônico, em suas formas de transmissão e varredura, e os microscópios de varredura por sonda.[3]

História

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Microscópios do século XVIII do Musée des Arts et Métiers, em Paris

Embora objetos semelhantes a lentes remontem a cerca de 4.000 anos e existam relatos gregos do século V a.C. sobre as propriedades ópticas de esferas cheias de água, seguidos por muitos séculos de textos sobre óptica, os primeiros usos conhecidos de microscópios simples, ou lupas, remontam à difusão das lentes em óculos no século XIII.[1][4][5][6][7] Os primeiros exemplos conhecidos de microscópios compostos, que combinam uma lente objetiva próxima da amostra com uma ocular para observar uma imagem real, surgiram na Europa por volta de 1620.[8]

Não se sabe quem inventou o microscópio composto, embora diferentes nomes tenham sido propostos ao longo dos anos. Algumas hipóteses surgiram nos centros de fabricação de óculos dos Países Baixos. Entre elas está a afirmação de que Zacharias Janssen o teria inventado em 1590, feita posteriormente por seu filho, ou de que a invenção teria sido de seu pai, Hans Martens, ou dos dois.[9][10] Outra hipótese atribui o aparelho ao vizinho e concorrente dos Janssen, o fabricante de óculos Hans Lippershey, que solicitou a primeira patente de telescópio em 1608.[11] Também se atribuiu a invenção ao expatriado Cornelis Drebbel, que possuía uma versão do instrumento em Londres em 1619.[12][13]

Galileu Galilei, também citado em algumas versões como inventor do microscópio composto, parece ter descoberto depois de 1610 que podia ajustar seu telescópio para focalizar objetos próximos. Depois de ver um microscópio composto construído por Drebbel e exibido em Roma em 1624, Galileu construiu sua própria versão aperfeiçoada.[14][15][16] Em uma carta a Federico Cesi, Giovanni Faber criou o nome italiano microscopio para o microscópio composto que Galileu apresentou à Accademia dei Lincei em 1625.[17][18][19][20] Galileu chamava o aparelho de occhiolino, "olhinho".[20]

René Descartes, em Dioptrique, de 1637, apresentou microscópios nos quais um espelho côncavo, com a concavidade voltada para o objeto, era usado junto com uma lente para iluminar o objeto, montado em um ponto que o mantinha no foco do espelho.[21]

Desenvolvimento dos microscópios ópticos modernos

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Microscópio de bancada criado por Joseph Gutteridge na década de 1860, na coleção do Herbert Art Gallery and Museum

O primeiro relato detalhado da anatomia microscópica de tecido orgânico baseado no uso de um microscópio surgiu em 1644, em L'occhio della mosca, ou The Fly's Eye, de Giambattista Odierna.[22]

O microscópio ainda era em grande parte uma novidade até as décadas de 1660 e 1670, quando naturalistas da Itália, dos Países Baixos e da Inglaterra começaram a empregá-lo no estudo da biologia. O cientista italiano Marcello Malpighi, chamado de pai da histologia por alguns historiadores da biologia, iniciou suas análises de estruturas biológicas pelos pulmões. A publicação de Micrographia, de Robert Hooke, em 1665, alcançou ampla repercussão, em grande parte devido às suas ilustrações. Ao observar a cortiça, Hooke chamou de "células" as pequenas cavidades que viu ao microscópio, introduzindo o termo em seu uso biológico.[23] Hooke também produzia pequenas lentes a partir de glóbulos de vidro formados pela fusão das extremidades de fios de vidro.[21]

Antonie van Leeuwenhoek alcançou ampliações de até 300× com um microscópio simples de lente única.[7] Ele prendia uma pequena lente esférica de vidro entre orifícios em duas placas metálicas rebitadas e usava uma agulha ajustável por parafusos para fixar a amostra.[24] Van Leeuwenhoek voltou a observar hemácias, depois de Jan Swammerdam, e espermatozoides, e ampliou o uso de microscópios para a observação da microestrutura biológica. Em 9 de outubro de 1676, relatou a descoberta de microrganismos.[25]

Microscópio composto binocular Carl Zeiss, 1914

O desempenho de um microscópio óptico composto depende da qualidade e do uso correto do sistema de lentes do condensador, que focaliza a luz sobre a amostra, e da lente objetiva, que capta a luz proveniente dela e forma a imagem.[8] Os primeiros instrumentos tinham limitações até que esse princípio fosse compreendido e desenvolvido, entre o fim do século XIX e o começo do século XX, e até que lâmpadas elétricas passassem a estar disponíveis como fontes de luz. Em 1893, August Köhler desenvolveu um princípio de iluminação de amostras, a Iluminação Köhler, que permite aproximar o microscópio óptico de seus limites teóricos de resolução. O método produz iluminação uniforme e reduz as limitações de contraste e resolução das técnicas anteriores. Outros avanços vieram da microscopia de contraste de fase, desenvolvida por Frits Zernike em 1953, e da iluminação por contraste de interferência diferencial, criada por Georges Nomarski em 1955. As duas técnicas permitem obter imagens de amostras transparentes e não coradas.[8]

Microscópios eletrônicos

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Microscópio eletrônico construído por Ernst Ruska em 1933

No início do século XX surgiu uma alternativa ao microscópio óptico, baseada no uso de um feixe de elétrons em vez de luz para gerar a imagem. O físico alemão Ernst Ruska, em trabalho conjunto com o engenheiro eletricista Max Knoll, desenvolveu em 1931 o primeiro protótipo de microscópio eletrônico, um microscópio eletrônico de transmissão ou MET.[26] O microscópio eletrônico de transmissão emprega princípios semelhantes aos do microscópio óptico, mas usa elétrons no lugar da luz e eletroímãs no lugar de lentes de vidro. Como o comprimento de onda associado aos elétrons pode ser muito menor que o da luz visível, o instrumento alcança resoluções muito maiores.

O desenvolvimento do MET foi seguido em 1935 pelo trabalho de Max Knoll no microscópio eletrônico de varredura.[27] Microscópios eletrônicos de transmissão já eram usados em pesquisas antes da Segunda Guerra Mundial e tiveram uso mais amplo depois do conflito. O microscópio eletrônico de varredura só se tornou disponível comercialmente em 1965.

Ruska, trabalhando na Siemens, desenvolveu o primeiro microscópio eletrônico de transmissão comercial. Na década de 1950 começaram a ser realizadas grandes conferências científicas dedicadas à microscopia eletrônica. Em 1965, o professor Charles Oatley e seu aluno de pós-graduação Gary Stewart desenvolveram o primeiro microscópio eletrônico de varredura comercial, vendido pela Cambridge Instrument Company com o nome "Stereoscan".[26]

A microscopia eletrônica também pode ser usada para identificar vírus.[28] Como a imagem é formada diretamente pela interação dos elétrons com a amostra, a morfologia de partículas virais e outras estruturas celulares pode ser examinada sem depender de reagentes de marcação específicos, auxiliando a identificação de agentes patogênicos.

Microscópios de varredura por sonda

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Primeiro microscópio de força atômica

De 1981 a 1983, Gerd Binnig e Heinrich Rohrer trabalharam na IBM, em Zurique, na Suíça, no estudo do fenômeno do tunelamento quântico. A partir da teoria do tunelamento quântico, criaram um instrumento prático de varredura por sonda capaz de detectar interações muito pequenas entre uma sonda e a superfície de uma amostra. A sonda se aproxima tanto da superfície que elétrons podem fluir continuamente entre ela e a amostra, produzindo uma corrente.[29]

O instrumento teve recepção inicial limitada devido à dificuldade das explicações teóricas que sustentavam seu funcionamento. Em 1984, Jerry Tersoff e D. R. Hamann, então nos Bell Labs da AT&T em Murray Hill, Nova Jérsia, começaram a publicar trabalhos que relacionavam a teoria aos resultados experimentais obtidos pelo aparelho. Instrumentos comerciais funcionais surgiram em 1985. Em 1986, Binnig, Calvin Quate e Christoph Gerber inventaram o microscópio de força atômica. No mesmo ano, Binnig e Rohrer receberam o Prêmio Nobel de Física pelo desenvolvimento da microscopia de tunelamento por varredura.[29]

Novos tipos de microscópios de varredura por sonda passaram a ser desenvolvidos à medida que avançaram as técnicas de fabricação de sondas e pontas ultrafinas.

Microscópios de fluorescência

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Microscópio de fluorescência com a torreta de cubos de filtros acima das objetivas, acoplado a uma câmera

Parte dos avanços mais recentes da microscopia óptica ocorreu com a expansão da microscopia de fluorescência em biologia.[30] Nas últimas décadas do século XX, em especial na era posterior ao sequenciamento dos genomas, foram desenvolvidas muitas técnicas de coloração fluorescente de estruturas celulares.[30] Entre elas estão a coloração química dirigida a estruturas específicas, como o composto DAPI, usado para marcar DNA, o uso de anticorpos conjugados a marcadores fluorescentes, empregado na imunofluorescência, e proteínas fluorescentes como a proteína fluorescente verde.[31] Esses fluoróforos permitem analisar estruturas celulares em escala molecular, em amostras vivas ou fixadas.

A expansão da microscopia de fluorescência levou ao desenvolvimento do microscópio confocal. O princípio foi patenteado por Marvin Minsky em 1957, mas a tecnologia de laser disponível limitava sua aplicação prática. Em 1978, Thomas Cremer e Christoph Cremer desenvolveram um dos primeiros microscópios confocais práticos de varredura a laser, e a técnica passou a ser adotada de forma ampla na década de 1980.[32][33]

Microscópios de super-resolução

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No começo do século XXI, grande parte da pesquisa sobre técnicas de microscopia óptica passou a se concentrar em métodos de super-resolução para amostras marcadas com fluoróforos. A microscopia de iluminação estruturada pode melhorar a resolução em cerca de duas a quatro vezes, enquanto técnicas como a microscopia por depleção de emissão estimulada, ou STED, alcançam resoluções próximas às obtidas por microscópios eletrônicos.[34] A resolução da microscopia óptica convencional é limitada pela difração, e as técnicas de super-resolução usam diferentes estratégias para contornar ou reduzir esse limite.[34] Stefan Hell recebeu o Prêmio Nobel de Química de 2014 pelo desenvolvimento da técnica STED, ao lado de Eric Betzig e William Moerner, que adaptaram a microscopia de fluorescência à visualização de moléculas individuais.[35]

Microscópios de raios X

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Os microscópios de raios X usam radiação eletromagnética, em geral na faixa dos raios X moles, para formar imagens de objetos. Avanços na óptica de lentes para raios X no início da década de 1970 tornaram esse tipo de instrumento uma opção prática para obtenção de imagens.[36] Esses microscópios são usados com frequência em tomografia, inclusive na microtomografia computadorizada, para produzir imagens tridimensionais de objetos, entre eles materiais biológicos que não tenham sido fixados quimicamente. Também se pesquisam sistemas ópticos para raios X duros, que possuem maior poder de penetração.[36]

Tipos

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Tipos de microscópio organizados pelos princípios de seus trajetos de feixe
Evolução da resolução espacial obtida com microscópios ópticos, eletrônicos de transmissão, ou MET, e eletrônicos com correção de aberração, ou ACTEM.[37]

Os microscópios podem ser separados em diferentes classes. Uma classificação considera aquilo que interage com a amostra para gerar a imagem, como luz ou fótons nos microscópios ópticos, elétrons nos microscópios eletrônicos, ou uma sonda nos microscópios de varredura por sonda. Outra classificação considera se o instrumento analisa a amostra ponto por ponto, como ocorre em microscópios ópticos confocais, microscópios eletrônicos de varredura e microscópios de varredura por sonda, ou toda a amostra de uma só vez, como nos microscópios ópticos de campo amplo e microscópios eletrônicos de transmissão.[30]

Microscópios ópticos de campo amplo e microscópios eletrônicos de transmissão usam a teoria das lentes, com lentes ópticas nos primeiros e lentes eletromagnéticas nos segundos, para ampliar a imagem gerada pela passagem de uma onda através da amostra ou por sua reflexão. As ondas são eletromagnéticas nos microscópios ópticos e feixes de elétrons nos microscópios eletrônicos. A resolução desses instrumentos é limitada pelo comprimento de onda da radiação usada para produzir a imagem. Comprimentos de onda menores permitem resoluções maiores.[30]

Microscópios ópticos e eletrônicos de varredura, como o microscópio confocal e o microscópio eletrônico de varredura, usam lentes para focalizar um ponto de luz ou um feixe de elétrons sobre a amostra e depois analisam os sinais gerados pela interação do feixe com ela. Esse ponto percorre a amostra para analisar uma região retangular. A ampliação aparente da imagem é obtida exibindo em uma tela relativamente grande os dados coletados em uma área fisicamente pequena da amostra. Esses instrumentos permanecem sujeitos aos limites de resolução impostos pela radiação usada para formar a imagem.[30]

Microscópios de varredura por sonda também analisam um ponto por vez e movem a sonda sobre uma região retangular da amostra para construir a imagem. Como não usam radiação eletromagnética nem feixes de elétrons para formar a imagem, não estão sujeitos ao mesmo limite de resolução dos microscópios ópticos e eletrônicos.

Microscópio óptico

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O tipo mais comum de microscópio, e o primeiro a ser inventado, é o microscópio óptico. Trata-se de um instrumento de medição óptico com uma ou mais lentes que produzem uma imagem ampliada de uma amostra colocada no plano focal. Os microscópios ópticos usam lentes refrativas de vidro e, em alguns casos, de plástico ou quartzo, para focalizar a luz no olho ou em outro detector. Microscópios ópticos baseados em espelhos operam pelo mesmo princípio.

A ampliação de um microscópio óptico que utiliza luz visível chega em geral a cerca de 1.250×, com um limite teórico de resolução de aproximadamente 0,250 µm, ou 250 nm.[30] Na prática, isso limita a ampliação útil a aproximadamente 1.500×. Técnicas especializadas, como a microscopia confocal de varredura a laser e o Vertico SMI, podem usar ampliações maiores, mas a resolução continua limitada pela difração. O emprego de comprimentos de onda menores, como o ultravioleta, é uma forma de melhorar a resolução espacial, assim como o uso da microscopia óptica de varredura de campo próximo.

Sarfus é uma técnica óptica que aumenta a sensibilidade de um microscópio óptico convencional a ponto de permitir a visualização direta de filmes com espessura nanométrica, até cerca de 0,3 nm, e de nano-objetos isolados com diâmetro de aproximadamente 2 nm. A técnica usa substratos não refletivos para microscopia de luz refletida com polarização cruzada.

A luz ultravioleta permite resolver detalhes microscópicos e obter imagens de amostras transparentes à luz visível. A radiação no infravermelho próximo pode ser usada para visualizar circuitos embutidos em dispositivos de silício unidos, pois o silício é transparente nessa faixa de comprimentos de onda.

Na microscopia de fluorescência, comprimentos de onda que vão do ultravioleta à luz visível podem ser usados para provocar fluorescência na amostra, permitindo observá-la diretamente ou por meio de câmeras sensíveis.

Células não coradas vistas em campo claro convencional, à esquerda, e por microscopia de contraste de fase, à direita

A microscopia de contraste de fase é uma técnica de iluminação de microscopia óptica na qual pequenas mudanças de fase da luz que atravessa uma amostra transparente são convertidas em mudanças de amplitude ou de contraste na imagem.[30] A técnica não exige coloração da lâmina. Isso permitiu estudar processos como o ciclo celular em células vivas.

O microscópio óptico tradicional também deu origem ao microscópio digital. Além da observação direta pelas oculares, ou em seu lugar, um sensor semelhante aos usados em uma câmera digital capta a imagem, que é então exibida em um monitor. Esses sensores podem empregar tecnologia CMOS ou CCD, conforme a aplicação.

Também é possível realizar microscopia digital com níveis muito baixos de luz para reduzir danos a amostras biológicas sensíveis, usando câmeras digitais de contagem de fótons. Experimentos mostraram que fontes que produzem pares de fótons emaranhados podem diminuir o risco de danos às amostras mais sensíveis à luz. Nessa aplicação de imagem fantasma à microscopia com poucos fótons, a amostra é iluminada com fótons infravermelhos. Cada um deles está espacialmente correlacionado a um parceiro emaranhado na faixa visível, que pode ser detectado de maneira eficiente por uma câmera de contagem de fótons.[38]

Microscópio eletrônico de transmissão moderno

Microscópio eletrônico

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Micrografia eletrônica de transmissão de uma célula em divisão durante a citocinese

Os dois tipos principais de microscópio eletrônico são o microscópio eletrônico de transmissão, ou MET, e o microscópio eletrônico de varredura, ou MEV.[30][31] Os dois possuem conjuntos de lentes eletromagnéticas e eletrostáticas que focalizam sobre a amostra um feixe de elétrons de alta energia.

No MET, os elétrons atravessam a amostra, em um processo análogo ao da microscopia óptica básica.[30] Isso exige preparação cuidadosa, pois os elétrons são fortemente espalhados pela maior parte dos materiais.[31] As amostras também precisam ser muito finas, com menos de 100 nm, para que os elétrons consigam atravessá-las.[30][31] Cortes de células contrastados com ósmio e metais pesados permitem observar claramente as membranas de organelas e proteínas como ribossomos.[31] Com resolução próxima de 0,1 nm, podem ser obtidas imagens detalhadas de vírus, que medem aproximadamente de 20 a 300 nm, e de uma molécula de DNA, com cerca de 2 nm de largura.[31]

O MEV, por sua vez, usa bobinas de varredura para percorrer a superfície de objetos maiores com um feixe fino de elétrons. A amostra não precisa necessariamente ser cortada em seções. Materiais não condutores podem precisar de um revestimento nanométrico de metal ou carbono.[30] O MEV permite obter rapidamente imagens da superfície da amostra e, em determinados instrumentos, pode operar com uma pequena quantidade de vapor de água para evitar o ressecamento do material.[30][31]

Microscopia de varredura por sonda

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Os diferentes tipos de microscópio de varredura por sonda correspondem aos diferentes tipos de interação que ocorrem quando uma pequena sonda percorre e interage com uma amostra. Essas interações podem ser registradas ou mapeadas em função da posição sobre a superfície para formar um mapa de caracterização.

Os três tipos mais comuns são o microscópio de força atômica, ou AFM, o microscópio óptico de varredura de campo próximo, conhecido pelas siglas NSOM ou SNOM, e o microscópio de corrente de tunelamento, ou STM.[39]

Um microscópio de força atômica possui uma sonda fina, em geral de silício ou nitreto de silício, presa a uma pequena alavanca flexível. A sonda percorre a superfície da amostra e o instrumento mede e mapeia as forças que surgem da interação entre a ponta e essa superfície.

Um microscópio óptico de varredura de campo próximo funciona de maneira semelhante ao AFM, mas sua sonda contém uma fonte de luz em uma fibra óptica, coberta por uma ponta que em geral possui uma abertura pela qual a luz passa. O instrumento pode captar luz transmitida ou refletida para medir propriedades ópticas muito localizadas da superfície, muitas vezes em amostras biológicas.

Microscópios de corrente de tunelamento possuem uma ponta metálica cujo extremo pode terminar em um único átomo. A ponta é presa a um tubo pelo qual circula corrente elétrica.[40] A ponta percorre a superfície de uma amostra condutora até surgir uma corrente de tunelamento. Um computador movimenta a ponta para manter essa corrente constante, e a imagem é formada a partir dos movimentos registrados.[39]

Superfície de uma folha vista por microscópio eletrônico de varredura

Outros tipos

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Os microscópios acústicos de varredura usam ondas sonoras para medir variações de impedância acústica. Seu princípio é semelhante ao do sonar, e esses aparelhos podem ser usados para detectar defeitos abaixo da superfície de materiais, inclusive em circuitos integrados. Em 4 de fevereiro de 2013, engenheiros australianos apresentaram um "microscópio quântico" destinado a realizar medições com precisão superior à de técnicas convencionais.[41]

Aplicativos móveis

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Celulares também podem ser usados como microscópios ópticos com o auxílio da câmera, de lentes adicionais e da iluminação do próprio aparelho. A ampliação e a resolução dependem da óptica acoplada, do sensor e do processamento da câmera, e esses sistemas podem apresentar limitações de qualidade de imagem em comparação com instrumentos dedicados.[42]

Ver também

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Referências

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Ligações externas

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