Piruvato quinase

Piruvato quinase M2, tetramer, Human.

Piruvato quinase é a enzima que participa da décima etapa da glicólise: catalisa a transferência irreversível de um grupo fosfato do fosfoenolpiruvato (PEP) para o ADP, gerando uma molécula de piruvato e uma de ATP. Para que a reação ocorra, também é necessária a presença de um cátion bivalente (geralmente Mg2+) e um cátion univalente (preferencialmente K+).

Classificação numérica (EC) da Piruvato Quinase.

Ensaios

A detecção da atividade da piruvato quinase pode ser associada à concentração de produto formado. Um exemplo é a detecção de piruvato, um dos produtos da reação catalisada pela enzima, por colorimetria ou fluorimetria. Além da piruvato quinase, adiciona-se a piruvato oxidase à reação, que oxida o piruvato gerado produzindo cor (a λ = 570 nm) e fluorescência (a Ex/Em = 535/587 nm).

Resumo de uma das formas de detecção da Piruvato Quinase.

Inibidores

Dentre os inibidores da piruvato quinase em humanos estão os produtos da reação catalisada por ela na glicólise - ATP e fosfoenolpiruvato -, além de frutose 1,6-bisfosfato, alanina, fenilalanina, cisteína, valina, ácido lisofosfatídico, oxalato, dentre outros.

Purificação

Para a purificação de piruvato quinase utilizam-se vários passos que incluem cromatografia de troca iônica e afinidade. Primeiramente, a enzima é isolada com o tecido, precipitada com sulfato de amônia e submetida a uma coluna de filtração em gel (para dessalinizar e carregar negativamente a amostra). Passa então por colunas catiônicas (cromatografia de troca iônica), onde grande quantidade de proteína é eluída com as lavagens. A eluição da piruvato quinase é feita utilizando-se efetores alostéricos, resultando em uma recuperação de 60% da enzima. Dentre os vários efetores alostéricos testados (tanto positivos quanto negativos) e de mais de um tipo de tampão, o mais efetivo na eluição da piruvato quinase e que não modificou significativamente sua atividade específica foi a frutose 1,6-bisfosfato (FBP). Também é possível separar as isoformas L e M da enzima, uma vez que só a L é eluída com o efetor alostérico. Este foi o primeiro trabalho que tornou possível a separação do complexo FBP e piruvato quinase, permitindo que o papel da FBP na piruvato quinase fosse avaliado. Até aquele momento, a separação das duas enzimas era difícil devido às suas propriedades cromatográficas muito similares.

Efeito do pH na atividade da enzima

De acordo com a avaliação do comportamento da piruvato quinase em diferentes pHs, foi possível observar que seu pH ótimo é em torno de 7,2. Com o cálculo do log da velocidade máxima da reação catalisada pela enzima em faixas abrangentes de pH (de ácidos a alcalinos), obtém-se um padrão de curva sugestivo de dois grupos ionizáveis na enzima.

Deficiência de Piruvato Quinase (PKD)

Visto que esta enzima é essencial principalmente para células que utilizam a glicólise como principal fonte de energia, como os neurônios e as hemácias, qualquer deficiência na via causa sérios danos e em alguns casos pode até ser fatal. A deficiência de piruvato quinase foi descrita em 1961 e é uma doença autossômica recessiva. Em hemácias, por exemplo, resulta em anemia hemolítica congênita, na qual as células sofrem danos variados devido à falta de 50% de seu total de ATP, que seria produzido pela piruvato quinase. Em recém-nascidos, a hiperbilirrubinemia severa de causa não identificada deve ser sempre considerada como um possível indício de PKD. Crianças com PKD podem ser dependentes de transfusão por anos até a esplenectomia, ou mesmo depois da cirurgia. A anemia é controlada na fase adulta, mas em períodos de estresse, gravidez ou infecções agudas, pode ser exacerbada. A PKD é considerada em pacientes com hemólise ativa sem nenhuma sugestão de processo autoimune, defeitos na membrana das hemácias ou hemoglobinopatia. Sem um histórico familiar, o diagnóstico da PKD torna-se complicado. O teste de piruvato quinase é, historicamente, o padrão ouro no diagnóstico da doença, mas só recentemente vem sendo inserido o teste do gene PK-LR (gene da isoforma R de piruvato quinase, a isoforma suscetível à PKD e presente em fígado e eritrócitos). Outras complicações podem advir da PKD, como hematopoiese extramedular, incluindo lesões que causam compressão da medula espinhal. Acredita-se que futuramente terapias gênicas estarão disponíveis para o tratamento da doença em humanos, uma vez que estudos em camundongos com vetores virais contendo o gene da piruvato quinase de fígado humano, resultam em expressão prolongada de piruvato quinase nas células vermelhas e órgãos hematopoiéticos. Além disso, um ativador farmacológico da piruvato quinase de células vermelhas está nos estágios iniciais de testes clínicos.