ARN-polimerase

ARN-polimerase ou RNA polimerase é a principal enzima do complexo enzimático responsável pela transcrição do DNA em RNA. Dessa forma podem ser classificadas como RNA polimerase dependente de DNA ou de RNA, respectivamente. Na verdade existem três tipos de RNA polimerases nos eucariontes: RNA-polimerase I, que auxilia na formação de rRNA (RNA ribossômico), a RNA-polimerase II, que sintetiza o mRNA citoplasmático e por fim a RNA-polimerase III que sintetiza pequenos rRNA e tRNA. Nos procariontes existe apenas um tipo de RNA polimerase que é capaz de sintetizar qualquer um dos tipos de RNA.

As RNA polimerase podem utilizar moléculas de DNA ou RNA como molde para a síntese de RNA. As que usam DNA são denominadas RNA polimerase DNA dependente, enquanto as que utilizam RNA como molde são chamadas RNA polimerase RNA dependente.

• RNA polimerase dependente de DNA: envolvida na transcrição do DNA, utiliza nucleotídeos tri-fosfato como substrato e depende de uma fita molde de DNA, podendo ser classificadas em 5 tipos;
• RNA polimerase dependente de RNA: atua na replicação do genoma de vírus de RNA e na amplificação de RNA de interferência em eucariotos, atuando de forma semelhante a RNA polimerase DNA dependente.

Estrutura

As estruturas tridimensionais das RNA polimerasess dependentes de DNA ou RNA são comumente descritas analogamente a uma mão direita, como ilustrado na figura 1, considerando a palma, os dedos e o dedão .  Em eucariotos e procariotos, a RNA polimerase consiste em um complexo proteico, enquanto nos vírus é geramelmente formada por apenas uma proteína.

[[File:Estruturas das RNA polimerases de eucariotos, procariotos e virus.jpg|thumb|Estruturas das RNA polimerases de eucariotos, procariotos e virus]]

Procariotos

Os procariotos possuem somente uma forma de RNA polimerase dependente de DNA. O cerne desta é composto por 4 subunidades: β, β', ω e α. Ao contrário das demais, a subunidade α está presente em duas cópias. Desta forma, o cerne da RNA polimerase bacteriana possui 5 subunidades, que compreendem a porção catalítica do complexo enzimático.  As subunidades β e β' se ligam inespecificamente ao DNA dupla fita imediatamente após à região transcrita. Adicionalmente, essas subunidades formam um canal que permite a entrada de ribonucleotídeos ao sítio ativo de transcrição e catalizam a polimerização do RNA, o qual é removido desta região por meio de outro canal entre β e β'. ω atua como uma chaperona para β' e assiste na montagem da RNA polimerase. As subunidades α também auxiliam neste processo ao conduzir o arranjo espacial das subunidades β na estrutura da RNA polimerase. Ao formar dímeros, os domínios N-terminais de cada subunidade α se associa exclusivamente a uma subunidade β, de forma que αI se liga à β e αII à β', aproximando β e β'. A porção C-terminal das subunidades α interagem com o DNA upstream ao promotor  e fatores de transcrição. Os fatores σ consistem na subunidade livre da RNA polimerase e se associam ao seu cerne por meio de interações com β e β'. Esses fatores conferem ligação ao DNA com especifidade de sequência.

Eucariotos

As RNA polimerases dependentes de DNA de eucariotos podem ser classificadas em 5 tipos (RNA pol I - V) de acordo com as subunidades que as compõem, estando envolvidas na transcrição de diferentes moléculas de RNA (ncRNA, mRNA, rRNA). As RNA polimerasess I-III apresentam uma estrutura principal constituída por 10 subunidades, sendo 5 (Rpb5, Rpb6, Rpb8, Rpb10 e Rpb12) comum às três, e variam na quantidade e nos tipos de proteínas que se associam a esse cerne. As RNA polimerases IV e V foram identificadas apenas em plantas e ainda não foram caracterizadas estruturalmente, mas foram descritas quanto à composição proteica, apresentando 12 subunidades encontradas na RNA polimerase II.

Vírus

As RNA polimerases dependentes de RNA ou DNA de vírus em geral consistem em uma proteína, no entanto RNA polimerase dependente de DNA codificada pelo Vaccinia virus é composta por subunidades. Essas polimerases apresentam sequências consenso que estão envolvidas em pontos chaves do processo de transcrição. As RNA pols dependentes de RNA e DNA possuem três motivos conservados em comum, determinados A, B e C. A e C ligam íons divalentes essenciais para a atividade catalítica da enzima, enquanto o motivo B auxilia na incorporação do ribonucleotídeo adequado.

Descrição geral

Ao desestabilizar a estrutura de fita dupla, as RNA polimerases expõem a sequência que será transcrita, permitindo que ribonucleosídeos trifosfato se liguem a esta por complementariedade de bases. Conforme essas enzimas percorrem a fita molde no sentindo 5'-3', são formadas ligações fosfodiéster entre os ribonucleotídeos por meio da hidrólise do trifosfato pelas RNA polimerases, liberando pirofosfato. Paralelamente, o pareamento das bases nitrogenadas é desfeito, de forma que a molécula de RNA em formação é estendida lateralmente a região transcrita. Isto e a rapidez desse processo permitem que mais de uma cópia de RNA possam ser feitas simultaneamente a partir da mesma sequência alvo. Quando esta consiste em DNA, a transcrição ocorre após o reconhecimento de regiões promotoras, que estão presentes em somente uma das fitas, por proteínas específicas que se associam às RNA polimerases.  

[[File:Esquema da transcrição pela RNA pol de células eucarióticas e procarióticas, com as fases de iniciação, alongamento e terminação2.jpg|thumb|Esquema da transcrição pela RNA pol de células eucarióticas e procarióticas, com as fases de iniciação, alongamento e terminação2]]

Mecanismo

Procariotos

Os promotores de procariotos apresentam duas sequências hexonucleotídicas que se localizam a 35 e 10 pares de base da extremidade 5’ do sítio em que se inicia a transcrição, definido como +1. Logo, essas sequências também são conhecidas como -35 e -10, respectivamente. Essas regiões são reconhecidas pelos fatores σ, os quais determinam os genes a serem transcritos por meio da seletividade à sequência do DNA. Ao contrário dos genes housekeeping, que são regulados pelo mesmo fator σ, as regiões promotoras de genes que são transcritos em resposta a estímulos internos ou externos são regulados por fatores σ específicos, de maneira que a transcrição desses depende primariamente da síntese e quantidade dos seus respectivos fatores σ. Portanto ao se associarem às RNA polimerases, os fatores σ determinam os genes a serem transcritos, desempenhando um papel crucial na regulação desse processo. O complexo proteico formado pela RNA pol e o fator σ é chamado de holoenzima RNA pol. Quando esta se liga ao DNA, denomina-se complexo promotor fechado. Após a desespiralização e abertura do DNA, forma-se o complexo promotor aberto, ou bolha de transcrição, e ocorre o pareamento dos ribonucleotídeos com a fita molde. Ao iniciar a síntese de RNA, a RNA polimerase armazena energia para quebrar a interação com a região promotora pelo fator σ. Enquanto isso não acontece, oligômeros de RNA são descartados, processo chamado iniciação abortiva. Quando o polímero que está sendo sintetizado atinge aproximadamente 10 pares de bases, o fator σ se dissocia da RNA polimerase, a qual deixa de interagir com o promotor e continua a transcrição ao longo da molécula de DNA até identificar um sinal de parada, ou terminador. Este pode ser Rho dependente ou independente. No primeiro caso, Rho se liga na extremidade livre do RNA que está sendo sintetizado e a partir da hidrólise de ATP, essa proteína consegue se deslocar pelo RNA e promover a dissociação da RNA polimerase do DNA, liberando, assim, a fita de RNA. O término independente de Rho acontece devido à transcrição de sequências invertidas geralmente ricas em citosina e guanina, que por serem complementares, se pareiam formando uma estrutura de grampo. Essas sequências são sucedidas por timina e adenina, que conferem uma ligação mais fraca entre o RNA e o DNA. Desta forma, quando o grampo formado empurra a molécula de RNA contra o DNA, a RNA pol se dissocia do complexo DNA-RNApol-RNA.  

Vírus

Nos vírus, o processo de transcrição de RNAm ou RNA não codificante pode ser realizado por RNA polimerase dependente de DNA ou RNA, de acordo com o tipo de genoma. Quando este consiste em RNA, as RNA pols dependentes de RNA também são responsáveis pela replicação do material genético. A regulação desses dois processos é realizada por meio da interação de outras proteínas virais e do hospedeiro com a RNA polimerase dependente de RNA.    

Ativação/Repressão da transcrição: controle da expressão gênica

As células expressam apenas parte do seu genoma, alterando o seu perfil transcricional e proteico ao longo da sua "vida" em resposta a pressões externas e/ou estímulos internos.  Esse controle da expressão gênica pode ocorrer em diversos processos, tais como: transcrição, processamento pós-transcricional, tradução, processamento pós-traducional, endereçamento e transporte da proteína, entre outros. A transcrição do DNA em RNA é o ponto de partida de grande parte da expressão fenotípica. Todas as células irão transcrever genes que codificam RNAs que possuem funções gerais e essenciais para a manutenção da viabilidade celular. Esses genes são conhecidos como genes housekeeping, que irão codificar proteínas com expressão constitutiva e essesnciais para a viabilidade celular. Entretanto, as células possuem genes que irão codificar proteínas diferenciadas que participarão de determinados processos, defindindo o seu tipo celular e fenótipo.

Uma das principais questões relacionadas com a regulação da expressão gênica é como a célula “sabe” o que deve ou não ser transcrito em um determinado momento. Assim, a maquinaria de transcrição da célula precisa identificar e responder a sinais diversificados, e geralmente distintos dos que regulam a replicação. Os genes que serão ou não transcritos são frequentemente controlados por sinais extracelulares, como no caso de bactérias, por moléculas presentes no meio de cultivo. Esses sinais são comunicados aos genes por proteínas reguladoras, que podem ser de dois tipos: reguladores positivos, ou ativadores, que irão aumentar a transcrição de um gene; e reguladores negativos, ou repressores, que irão diminuir ou até interromper a transcrição de um gene.

Uma das formas que a maquinaria de transcrição da célula tem de regular e minimizar erros na transcrição do DNA é a especialização da RNA polimerase nos diferentes tipos mostrados anteriormente. Os RNAs ribossomal e transportador são a grande maioria dos transcritos e não serão traduzidos em proteínas, tendo sua função como RNA, sendo os tRNA responsáveis pela transferência de um aminoácido específico para uma cadeia polipeptídica nascente durante a síntese proteica, e o rRNA constituintes dos ribossomos, as máquinas celulares que irão realizar a síntese de proteínas. Assim, os mRNA transcritos pela RNA pol II, são responsáveis por codificar a grande maioria das proteínas presentes na célula, sendo um importante ponto de regulação da expressão gênica. 

Sequências próximas à genes que serão transcritos possuem características ativadoras (localizada em regiões anteriores à sequência transcrita) ou inibidoras (localizadas em regiões antes ou após às sequências dos genes). Tais regiões atuam como regiões de interação para ativadores e repressores da transcrição.  Por exemplo, a ação de fatores promotores da transcrição em regiões específicas como a sequência TATA e a Inr (initiator sequence), sinalizam para que a RNA polimerase II atue sobre aquela sequência, realizando a transcrição de uma proteína necessária naquele momento para a célula. Portanto, os fatores regulatórios da transcrição atuam como moléculas sequência-específicas, que exercem sua função induzindo ou inibindo a transcrição de um gene, através de alterações do reconhecimento da sequência pela RNA polimerase II

A transcrição da maioria dos genes requer a presença de complexos proteicos adicionais a RNA polimerase, como é o caso dos ativadores da transcrição e de mediadores que irão ajudar a transferir o sinal desses ativadores para os complexos que irão formar a maquinaria de transcrição. Os requisitos para os ativadores da transcrição variam muito, sendo conhecidos poucos ativadores que funcionam para diversos promotores e alguns ativadores que são específicos para apenas alguns promotores. Assim, os ativadores da transcrição são capazes de ativar ou modular positivamente a transcrição de um determinado gene, a presença desses ativadores irá aumentar a estabilidade do complexo da RNA polimerase, levando a um aumento da transcrição do gene que eles está modulando (Figura 7A).  Muitos ativadores funcionam em resposta a mudanças no ambiente celular, uma vez que podem se ligar a diferentes  moléculas sinalizadoras. Os sítios de ligação dos ativadores nem sempre necessitam estar próximos ao promotor, havendo a criação de uma alça no DNA, juntamente com os fatores de transcrição que formam a maquinaria da RNA polimerase. Ativadores da transcrição interagem com um ou mais componentes do complexo mediador, em sítios específicos de interação que irão diferir de um ativador para outro.

Algumas moléculas conhecidas como repressoras podem interagir com o mediador ou com os domínios de ativação e impedir a ligação desses aos fatores de transcrição, diminuindo ou parando totalmente a transcrição daquele gene (figura 7B). 

[[File:Ativadores e repressores da transcrição.jpg|thumb|Ativadores e repressores da transcrição]]

[[File:Ativadores e repressores da transcrição.jpg|Ativadores e repressores da transcrição]]

Transcrição não codificante

Os RNA não codificantes (ncRNA) são aqueles que não atuam como molde para a tradução (mRNA), logo, inclui-se nesta definição os íntrons. No entanto, essas moléculas são produtos funcionais que podem estar associadas à funções estruturais ou à regulação da expressão gênica, podendo ser transcritos constitutivamente ou mediante estímulo.  Em mamíferos, as sequências correspondestes aos ncRNAs podem ser intergênicos, no entanto geralmente estão localizadas até 2 kb do sítio de iniciação de sequências que codificam proteínas, sendo a maioria pertencente à fita antisenso. Portanto adicionalmente à transcrição clássica, as regiões presentes na fita antisenso ao promotor do gene também são transcritas, processo comumente chamado de transcrição divergente.  Apesar de não ser totalmente esclarecido como ocorre a ativação da transcrição dos ncRNA, sabe-se que as RNA pols II, IV e V realizam esse processo. Em um locus, a RNA polimerase II pode realizar transcrição divergente paralelamente à transcrição do gene. Em eucariotos e em vírus, as RNA pols dependentes de RNA também transcrevem ncRNA. Adicionalmente, essas enzimas podem ser responsáveis pela amplifição de RNA de interferência nos eucariotos.

Inibidores farmacológicos da RNA polimerase

Muitos fármacos irão atuar inibindo processos fisiológicos, incluindo a transcrição. Esse é o caso da rifampicina e da actinomicina. As rifamicinas foram isoladas em 1959, da bactéria Streptomyces mediterranei, atualmente conhecida como Amycolatopsis rifamycinica. As rifamicinas irão agir formando um complexo com a RNA polimerase de procariotos, inibindo a transcrição de RNA dependente de DNA. Elas interagem apenas com a RNA polimerase de bactérias, não inibindo a enzima em mamíferos. A associação da rifampicina com a isoniazida é muito utilizada para o tratamento da tuberculose. Muitos mutantes se tornam resistentes a esse fármaco, uma vez que essas mutações levam a alterações na RNA polimerase, fazendo com que essas enzimas não interajam com o fármaco e tornando essas bactérias resistentes

A actinomicina D, foi isolada de Streptomyces parvullus e, embora seja um antibiótico, é utilizada com um fármaco antineoplásico. Ela irá inibir a transcrição através da ligação ao DNA dupla-fita, intercalando com o DNA e impedindo que ele se abra para que ocorra a transcrição. Em concentrações baixas, esse fármaco não irá impedir a replicação do DNA, atuando apenas na transcrição. Entretanto, durante o tratamento do câncer ele é utilizado para bloquear o crescimento de novas células tumorais  

Ver também

• RNA polimerase DNA-dependente
• RNA polimerase RNA-dependente
• DNA polimerase RNA-dependente
• DNA polimerase DNA-dependente