Placa de Petri

.- DISEÑO DE LOS MEDIOS DE CULTIVO A la hora de diseñar un medio de cultivo no sólo hay que tener en cuenta los nutrientes sino también las condiciones físicas que permitan el crecimiento de los microorganismos.

1.- Aporte de nutrientes

La cantidad y naturaleza de los nutrientes en un medio de cultivo viene determinada por el rendimiento de un producto en especial además de los requerimientos nutricionales del microorganismo.

2.- pH

Un microorganismo puede alterar el pH del medio de cultivo como resultado de las sustancias producidas por el propio microorganismo; por ejemplo:

Utilización de carbohidratos ----> Producción de ácidos orgánicos ----> Acidificación

Catabolismo de proteínas ----> Producción de materiales nitrogenados ----> Alcalinización

Estos cambios pueden llegar a ser tan grandes que inhiban el crecimiento del microorganismo. Estos cambios se pueden prevenir controlando el pH mediante sistemas tampón. Uno de los más utilizados en microbiología es la combinación de KH2PO4 y K2HPO4 tamponando el medio a un pH de aproximadamente 6,8.

3.- Necesidades de gases

Los gases principales que afectan al desarrollo microbiano son el oxígeno y el dióxido de carbono. Las bacterias presentan una respuesta amplia y variable al oxígeno libre clasificándose en cuatro grupos:

i.- Aerobias: bacterias que se desarrollan en presencia de oxígeno libre. ii.- Anaerobias: bacterias que se desarrollan en ausencia de oxígeno libre. iii.- Anaerobias facultativas: bacterias que se desarrollan tanto en presencia como en ausencia de oxígeno libre.

iv.- Microaerófilas: bacterias que crecen en presencia de pequeñas cantidades de oxígeno libre.

Para desarrollar bacterias aerobias se incuban los medios de cultivo en agitación constante o introduciendo aire estéril en el medio.

Los anaerobios estrictos son muy sensibles al O2 por lo que se debe evitar la exposición de estos microorganismos al O2. Se puede obtener un ambiente de anaerobiosis por los siguientes métodos:

A.- Agregando al medio de cultivo un compuesto reductor, como es el tioglicolato sódico, para disminuir el contenido de O2. B.- Quitando el O2 por procedimientos mecánicos y reemplazándolo por N2 o CO2. C.- Mediante reacciones químicas dentro del recipiente que contiene el medio de cultivo inoculado para combinar el oxígeno libre con otro compuesto. Por ejemplo: al encender una vela se transforma el oxígeno en dióxido de carbono.

4.- Suministro de luz

Los organismos fotosintéticos deberán ser expuestos a una fuente de iluminación ya que la luz es su fuente de energía. Esta fuente de iluminación no debe plantear problemas de variación de temperatura, por lo que suelen usarse lámparas fluorescentes con un desprendimiento mínimo de calor.

5.- Control de la temperatura

El desarrollo de las bacterias depende de reacciones químicas, y la velocidad con que se efectúan estas reacciones está influída por la temperatura, por lo que la temperatura puede en parte determinar la velocidad de crecimiento de los microorganismos. Cada especie microbiana posee una temperatura óptima de crecimiento clasificándose según esto en los siguientes grupos: i.- Psicrófilas: capaces de desarrollarse a 0° C o menos. Su temperatura óptima es alrededor de los 15° C. ii.- Mesófilas: crecen mejor entre 25 y 40° C.

iii.- Termófilas: crecen mejor entre 45 y 60° C.

6.- Otros requerimientos

Halófilas: bacterias que para su crecimiento requieren altas concentraciones de sal (10 - 15%). Son aquellas bacterias aisladas del mar y ciertos alimentos.

Otras bacterias, como las aisladas en las fosas marinas, requieren presiones superiores a las normales.

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II.- TIPOS DE MEDIOS DE CULTIVO 1.- Estado:

A.- Medios líquidos

B.- Medios sólidos: llevan un agente solidificante (Agar) que es un polisacárido acídico producido por ciertas algas rojas que gelifica por debajo de 45° C. Se usa a una concentración del 1,5%.

C.- Medios semisólidos: agar a una concentración del 0,7%.

2.- Composición:

A.- Medios sintéticos o químicamente definidos. Llevan fuente de carbono, fuente de nitrógeno, sales que suplan iones (P, K, Mg, Fe, Ca...), otros elementos como son estimuladores del crecimiento (eritritol para Brucella abortus) pero siempre a concentraciones conocidas.

B.- Medios complejos o de composición indefinida. Estos medios llevan ingredientes como extracto de levadura, peptona, infusión de cerebro, extracto de carne, etc. que contienen nutrientes en abundancia pero sin saber con exactitud la composición cualitativa ni cuantitativa de estos nutrientes.

C.- Medios de enriquecimiento. Son medios complejos (normalmente) con aditivos adicionales para favorecer el crecimiento de determinados microorganismos (particularmente heterótrofos exigentes). Ejemplo: adicción de sangre, suero o extractos de tejidos de animales y plantas.

D.- Medios selectivos. Son aquellos que favorecen por su diseño el crecimiento específico de un microorganismo particular (o grupo de microorganismos). Es de gran utilidad para el aislamiento de microorganismos a partir de una población microbiana mixta. Ejemplo: CO2 como fuente de carbono es selectivo para autotrofos; adiccionando cristal violeta se inhibe el crecimiento de los Gram (+); utilizando maltosa como única fuente de carbono sólo crecerán los que usen maltosa.

E.- Medios diferenciales. Son aquellos destinados a facilitar la discriminación de microorganismos de una mezcla por sus propiedades diferenciales de crecimiento en dichos medios. Ejemplo: Agar sangre diferencia hemolíticos de no hemolíticos; McConkey diferencia lactosa (+) de lactosa (-).

F.- Medios de mantenimiento. Suelen ser distintos a los de crecimiento óptimo ya que el crecimiento rápido y prolífico suele ocasionar la muerte rápida de las células. Ejemplo: al añadir glucosa y utilizarla los microorganismos producen ácidos, acidificándose el medio por lo que es preferible no utilizar glucosa en los medios de mantenimiento.

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III.- AISLAMIENTO DE MICROORGANISMOS EN CULTIVO PURO Un cultivo puro es aquel formado por células provenientes de una sóla inicial y por tanto pertenecientes a la misma especie y cepa. Es una situación artificial ya que en la Naturaleza los microorganismos se encuentran formando poblaciones mixtas y heterogéneas. Es un artificio obligado para estudiar cada especie y cepa de microorganismo en particular.

1.- Métodos para aislar cultivos puros

i.- Técnica de siembra por estrías en placa.

ii.- Técnica de vertido en placa.

iii.- Técnica de enriquecimiento del cultivo: consiste en diseñar condiciones de cultivo que favorezcan específicamente al microorganismo que queremos aislar y que se encuentra en pequeñas cantidades.

iv.- Técnica de las diluciones en serie: se utiliza para microorganismos cuya proporción es mayoritaria dentro de la población mixta.

v.- Técnica de aislamiento de una sola célula mediante un micromanipulador.

2.- Mantenimiento y preservación de cultivos puros

Se utilizan diversos procedimientos de acuerdo con las características y la tolerancia del microorganismo en cuestión: i.- Resiembra periódica en medios frescos. ii.- Preservación de cultivos con una capa de aceite mineral. iii.- Liofilización

iv.- Almacenamiento a temperaturas muy bajas en presencia de agentes estabilizantes como glicerol o dimetilsulfóxido. Nitrógeno líquido (- 196° C).

3.- Colecciones de cultivos La primera colección conocida de cultivos tipo fue la de Kral en Praga (1900). Estados Unidos (ATCC) está en Rockville (Maryland). Francia (CIP) está en el Instituto Pasteur (París). Reino Unido (NCYC) está en Norwich. España (CECT) está en Valencia. Alemania (DSM) está en Darmstadt. Holanda (CBS) está en Baarn. Japón (IFO) está en Osaka.