Sequenciamento de fragmentos de DNA associados a sítios de restrição (RADseq): diferenças entre revisões

Origem: Wikipédia, a enciclopédia livre.
Ver a alteração posterior →
Conteúdo apagado Conteúdo adicionado
VisualTexto wiki
nova página: == Sequenciamento de fragmentos de DNA associados a sítios de restrição (RADseq) == O '''sequenciamento de fragmentos de DNA associado a sítios de restrição''' (do inglês ''R...
Etiquetas: Inserção de predefinição obsoleta Provável parcialidade Editor Visual: Trocado
(Sem diferenças)

Revisão das 22h07min de 31 de outubro de 2019

Sequenciamento de fragmentos de DNA associados a sítios de restrição (RADseq)

O sequenciamento de fragmentos de DNA associado a sítios de restrição (do inglês Restriction site associated DNA sequencing, RADseq) é uma metodologia que descreve o sequenciamento dos marcadores RAD, que são um tipo de marcador molecular baseado em sítios de restrição enzimática ao longo do genoma.[1] Essa metodologia consiste na digestão do DNA genômico por uma ou mais enzimas de restrição e ligação dos fragmentos a adaptadores, o que permite a multiplexação de centenas a milhares de indivíduos, permitindo uma representação reduzida do genoma, dos loci próximos aos sítios de restrição. Dessa forma caracteriza-se por um método de sequenciamento de bibliotecas de representação reduzida (RRLs, do inglês reduced-representation libraries). [2]

Metodologia

A principal novidade de metodologias como o RADseq em relação ao sequenciamento de DNA de nova geração (NGS) na plataforma Illumina é o método de fragmentação do DNA. No sequenciamento NGS tradicional, o DNA é fragmentado mecanicamente, enquanto que metodologias de representação reduzida do genoma utilizam enzimas de restrição para realizar essa fragmentação. Na metodologia RADseq original, apenas uma enzima de restrição é utilizada, gerando fragmentos com uma extremidade cortada pela enzima e portanto contendo seu sítio de restrição, e a outra extremidade com sequência aleatória, pois é cortada mecanicamente. Adaptadores que contém a sequência do primer de sequenciamento da Illumina seguida por uma sequência de identificação chamada barcode (em português, código de barras) são então ligados às extremidades dos fragmentos. Esses barcodes permitem a identificação de cada amostra, de modo que é possível multiplexar várias amostras em uma mesma reação de sequenciamento. Os fragmentos de DNA gerados são então selecionados por tamanho, reduzindo então a quantidade do genoma a ser sequenciado. Essa preparação do DNA para ser sequenciado é chamada de preparo de biblioteca (ou construção de biblioteca). [2]

Aplicações

Métodos de representação reduzida do genoma como o RADseq são muito úteis em estudos na área de genômica evolutiva, ecológica e conservação de espécies. Estudos populacionais necessitam de grande número amostral, sendo necessário, portanto, alternativas mais rápidas e baratas ao sequenciamento do genoma inteiro, mas que sejam representativas. Trabalhos que utilizaram RADseq foram capazes de identificar dezenas de milhares de polimorfismos de nucleotídeo único (SNPs) no genoma de suas espécies de interesse.[2] O mapeamento de SNPs ao longo de genoma permite estimar tamanho efetivo de populações, responder perguntas referentes à adaptação, introgressão, estruturação populacional, e estudos filogenéticos [3]. A metodologia RADseq é voltada especialmente para estudos na área de genômica evolutiva mas também pode ser aplicado no campo da saúde humana, como no estudo da evolução de tumores. [4]

Histórico

O RADseq foi descrito em 2008 por Nathan Baird e colegas [2], o mesmo grupo descreveu os marcadores RAD no ano anterior, na Universidade de Oregon, Estados Unidos.[1] Desde então foi amplamente utilizado, principalmente em trabalhos na área de ecologia molecular e genômica evolutiva, e novas abordagens foram criadas, se tornando hoje uma família de métodos[5].Em 2012, por exemplo, Brant Peterson descreveu uma metodologia variante chamada “double-digest RADseq” (ddRADseq), que inclui uma segunda enzima de restrição, diferentemente do RADseq original que utiliza apenas uma. Dessa forma as duas extremidades de cada fragmento de DNA são conhecidas, o que permite maior redução da biblioteca, e tamanhos de fragmentos mais específicos, reduzindo custo.[6] A partir desta variante e do RADseq original outras novas variantes também surgiram, dando origem a dezenas de metodologias derivadas, como 3RAD[7], 2bRAD[8], hyRAD[9], quaddRAD[10], entre outras[11].

Em princípio os marcadores RAD eram utilizados através de SNPs arrays, posteriormente foram adaptadores para o sequenciamento NGS.

Referências

  1. ↑ a b Miller MR; Dunham JP; Amores A; Cresko WA; Johnson EA (2007). «Rapid and cost-effective polymorphism identification and genotyping using restriction site associated DNA (RAD) markers». Genome Research. 17 (2): 240-248. PMC 1781356Acessível livremente. doi:10.1101/gr.5681207 
  2. ↑ a b c d Baird NA; Etter PD; Atwood TS; Currey MC; Shiver AL; Lewis ZA; Selker EU; Cresko WA; Johnson EA (2008). «Rapid SNP discovery and genetic mapping using sequenced RAD markers». PLoS One. 3 (10): e3376. doi:10.1371/journal.pone.0003376 
  3. ↑ Andrews KR; Good JM; Miller MR; Luikart G; Hohenlohe PA (2017). «Harnessing the power of RADseq for ecological and evolutionary genomics.». Nat Rev Genet. 17 (2): 81-92. doi:10.1038/nrg.2015.28 
  4. ↑ Perry EB; Makohon-Moore A; Zheng C; Kaufman CK; Cai J; Iacobuzio-Donahue CA; White RM (2017). «Oncotarget». Tumor diversity and evolution revealed through RADseq. 8 (26): 41792-41805. doi:10.18632/oncotarget.18355 
  5. ↑ Campbell, Erin O.; Brunet, Bryan M. T.; Dupuis, Julian R.; Sperling, Felix A. H. (2018). Matschiner, Michael, ed. «Would an RRS by any other name sound as RAD?». Methods in Ecology and Evolution (em inglês). 9 (9): 1920–1927. doi:10.1111/2041-210X.13038 
  6. ↑ Peterson, Brant K.; Weber, Jesse N.; Kay, Emily H.; Fisher, Heidi S.; Hoekstra, Hopi E. (31 de maio de 2012). Orlando, Ludovic, ed. «Double Digest RADseq: An Inexpensive Method for De Novo SNP Discovery and Genotyping in Model and Non-Model Species». PLoS ONE (em inglês). 7 (5): e37135. ISSN 1932-6203. PMC PMC3365034Acessível livremente Verifique |pmc= (ajuda). PMID 22675423. doi:10.1371/journal.pone.0037135 
  7. ↑ Gramham CF; Glenn TC; McArthur AG; Boreham DR; Kieran R; Lance S; Wilson JY (2015). «Impacts of degraded DNA on restriction enzyme associated DNA sequencing (RADSeq)». Molecular Ecology Resources. 15: 1304-1315. doi:10.1111/1755-0998.12404 
  8. ↑ Wang S; Meyer E; McKay JK; Matz MV (2012). «2b-RAD: A simple and flexible method for genome-wide genotyping». Nature Methods. 9 (9): 808-812. doi:10.1038/nmeth.2023 
  9. ↑ Suchan T; Pitteloud C; Gerasimova NS; Kostikova A; Schmid S; Arrigo N; Alvarez N (2016). «Hybridization capture using RAD probes (hyRAD), a new tool for performing genomic analyses on collection specimens.». PLoSONE. 11 (11): e0151651. doi:10.1371/journal.pone.0151651 
  10. ↑ Franchini P; Parera DM; Kautt AF; Meyer A (2017). «quaddRAD: A new high-multiplexing and PCR duplicate removal ddRAD protocol produces novel evolutionary insights in a nonradiating cichlid lineage.». Molecular Ecology. 28 (28): 2783-2795. doi:10.1111/mec.14077 
  11. ↑ Campbell, Erin O.; Brunet, Bryan M. T.; Dupuis, Julian R.; Sperling, Felix A. H. (2018). Matschiner, Michael, ed. «Would an RRS by any other name sound as RAD?». Methods in Ecology and Evolution (em inglês). 9 (9): 1920–1927. doi:10.1111/2041-210X.13038 
Obtida de "https://pt.wikipedia.org/w/index.php?title=Sequenciamento_de_fragmentos_de_DNA_associados_a_sítios_de_restrição_(RADseq)&oldid=56609850"