Interação proteína-proteína

A rede de interação proteína-proteína (IPP ou PPI do termo inglês "Protein-Protein Interaction") codifica as interações entre as proteínas de um organismo e auxilia no mapeamento do seu interatôma. Nessa rede duas proteínas estão conectadas se existe evidência de que elas interagem. As proteínas são alguns dos componentes biológicos de um organismo, elas exercem diversas funções biológicas a partir das suas interações e são centrais para a maioria dos processos biológicos celulares do organismo, desde o metabolismo até resposta a estímulos. O mapeamento completo das interações de proteínas que podem ocorrer no sistema complexo de um organismo é chamado de interatôma e faz parte do estudo da Interatômica, que compreende todo o conjunto de interações moleculares que ocorre em uma determinada célula. Para entender um sistema complexo é necessário entender como seus componentes se interagem e as redes são ótimos modelos para codificar essas interações. Uma rede é um catálogo dos componentes de um sistema, geralmente chamados de nós ou vértices, e das interações diretas entre eles, chamadas conexões ou arestas. A representação matemática de uma rede é chamada de grafo segundo a Teoria dos Grafos.

As interações de proteínas podem ser medidas por métodos biológicos experimentais ou preditas por métodos computacionais. Os métodos experimentais seguem duas categorias: (1) métodos binários que medem interações físicas diretas entre pares de proteínas, sendo o sistema duplo-híbrido em leveduras (Y2H do inglês yeast two-hybrid) o método genético de larga escala mais utilizado; e (2) métodos co-complexos que medem interações físicas entre grupos de proteínas sem diferenciar se elas são diretas ou indiretas, sendo a purificação por afinidade em tandem acoplada a espectrometria de massas (TAP-MS do inglês tandem affinity purification coupled to mass spectrometry) o método proteômico de larga escala mais utilizado. Os métodos computacionais englobam predições de IPPs a partir da análise de dados biológicos heterogêneos, como sequência, evolução, expressão e estrutura de proteínas. A maioria dos métodos computacionais podem ser agrupados nos baseados em simulação, usualmente feitos em baixa escala devido a um alto custo computacional, e nos baseados em estatística/aprendizado de máquina, os quais podem ser aplicados em larga escala.

Uma rede IPP completa representando um mapa completo da interatôma de um organismo seria um passo enorme na direção de entender as funções de seus genes e o funcionamento do seu corpo a nível celular. Porém esse dado é inviável de ser obtido experimentalmente para especies mais complexas, desde a levedura que possui a interatôma bastante estudado até o do humano que ainda é pouco conhecido. Para completar o interatôma do ser humano que possui em torno de 20 000 a 25 000 proteínas seriam necessários de 20 000 * 20 000 / 2 a 25 000 * 25 000 / 2 experimentos, totalizando 200 milhões a 300 milhões experimentos. Isso implica na incompletude dos dados já que não sabemos de fato quais são essas interações e não conseguimos medir todas elas. Logo, isso também implica na impossibilidade de validação dos métodos de detecção de interações. Sem validação, a frequência de falsos positivos detectados nos ensaios experimentais pode ser muito alta, em um estudo de 2006 estimou-se que menos do que 50% do interatôma da levedura era conhecido e ainda menos se sabia sobre o interatôma humano.

A recorrência de repetições das interações de proteínas em diferentes ensaios experimentais pode auxiliar na seleção de interações mais confiáveis, classificadas como "dados principais". Dessa forma, a disponibilização dos dados não tratados de interação de proteínas poderia contribuir na detecção do conjunto de "dados principais", e na subsequente criação de uma rede IPP mais confiável. De toda forma, o estudo de redes IPPs da levedura já revelou sua utilidade descobrindo funções de proteínas, prevendo comportamento celular, e na analise de regulação de genes complexos. Espera-se que as redes IPPs humanas sejam igualmente informativas.

Rede IPP do HIV-1 Humano em visão de multi camadas, cada camada representa diferentes dados de interação de proteínas e à direita o resultado da agregação de todos

Interação Proteína-Proteína

A definição de IPPs deve considerar: (1o) a interface de interação entre as proteínas deve ser intencional e não acidental, ou seja, resultado de eventos/forças biomoleculares selecionadas especificamente; e (2o) a interface de interação deve ser não-genérica, ou seja, evolui para um objetivo especifico distinto de funções totalmente genéricas como produção de proteínas, degradação e outras. Outro elemento essencial para definir IPPs é o contexto biológico em que a interação acontece. As interações dependem do tipo celular em que as proteínas se encontram, da fase e do estado do ciclo celular, do estagio de desenvolvimento, condições ambientais da célula, modificações na proteína (por exemplo fosforilação), presença de co-fatores, e presença de outros parceiros para ligação.

Os tipos de IPP podem ser classificados em 4 subdivisões diferentes dependendo das características do complexo proteico (ou de proteínas) formado pelas duas ou mais proteínas envolvidas na interação:

1. Complexos homoméricos ou heteroméricos: se a interação ocorre entre proteínas (subunidades) idênticas elas formam um complexo homoméricos (em sua maioria simétrico e mais estável), em contrapartida se a IPP ocorre entre proteínas (subunidades) diferentes ela forma um complexo heteroméricos (estabilidade variada);
2. Complexos obrigatórios e não obrigatórios: se as proteínas envolvidas na IPP são instáveis quando isoladas e são estáveis no complexo este é considerado obrigatório, caso contrário se as proteínas são estáveis independentemente quando isoladas o complexo resultante da IPP é não obrigatório.
3. Complexos Transientes e Permanentes: se após a ocorrência da IPP as duas proteínas permanecem ligadas no complexo esse é dito permanente (usualmente muito estável), em contrapartida complexos em interações transientes se associam e desassociam temporariamente e dependendo da afinidade entre as proteínas podem formar uma interação forte ou fraca. Interações obrigatório são permanentes enquanto interações não obrigatórios podem ser transientes ou permanentes;
4. Complexos Desordenados-a-Ordenados: se a IPP envolve proteínas desordenadas, as quais possuem regiões não estruturadas que se adaptam a conformação da proteína parceira, o complexo é dito desordenado. Caso contrário, se a estrutura das proteínas envolvidas na IPP são estáveis e ordenadas (suas estruturadas não se modificam/adaptam na ligação) o complexo é dito ordenado.

A proteína humana fosfatase 2A (PP2A) em um complexo heteroméricos, mostrado a interação entre a subunidade reguladora A (vermelho), subunidade reguladora B56 (verde), e a subunidade catalítica (azul escuro). Renderizado do PDB ID 2IAE

As estruturas de alguns dos complexos biológicos formados pelas IPPs podem ser encontradas em complexos cristalográficos obtidos por meio de cristalografia de raio-X no Banco Mundial de Proteínas (PDB do inglês "Protein Data Bank"). O PDB fornece as imagens e as sequencias de proteínas resolvidas e depositadas pela comunidade de biologia estrutural.

Métodos Experimentais

A acurácia dos métodos experimentais de larga escala para a detecção de interações de proteínas sofre com uma alta taxa de falsos positivos, especialmente nos dados TAP-MS não editados para pares de proteína que estão no mesmo complexo mas não em contato físico direto. As conexões calculadas com o TAP-MS são atribuídas usando o modelo de raios (do inglês "spoke model") para diminuir a taxa de falsos positivos. Nesse modelo uma proteína alvo é utilizada para "capturar" um grupo de proteínas presas que interagem direta ou indiretamente com o alvo e são todas conectadas a este na rede. Já no caso do sistema Y2H o maior desafio é a falha em não considerar os aspectos dinâmicos da interação de proteínas. Isso gera falsos positivos na interação de proteínas que se encontram em compartimentos celulares completamente diferentes, e logo, não interagem de fato no organismo. E falsos negativos quando a interação ocorre após modificações post-translational, o que não é possível com o sistema Y2H. Essa incerteza diminui a intersecção entre diferentes conjuntos de dados de interação de proteínas e eles ainda são enviesados para proteínas mais abundantes.

Interações da proteína ERICH5 em uma rede com topologia do modelo de raios ("spoke model")

Métodos Computacionais/Preditivos

A limitação dos métodos experimentais cria a necessidade por métodos computacionais de predição de interações de proteínas. Várias abordagens computacionais existem para predizer IPPs. Os métodos baseados em simulação modelam as forças governando as interações de proteínas, usualmente a nível atômico, e calculam a força da interação. Esses métodos incluem simulação dinâmica e docking de proteínas, e são mais utilizados no estudo da dinâmica das proteínas do que na determinação das suas interações devido a um alto custo computacional. Por outro lado os método estatísticos/aprendizado de máquina podem ser aplicados em larga escala e utilizam informação de interações conhecidas de proteínas para fazer as predições. Além desses dois métodos principais, a predição computacional par-a-par de IPPs e sua analise pode ser feita usando mapeamento de ortólogos, eventos de fusão de gene/domínio, co-ocorrência de domínio, e co-expressão de gene. Uma comparação desses métodos feita em 2016 é apresentada na tabela a seguir.

Tabela 1. Comparação de Métodos Preditivos de IPP

Método	Entrada	Melhor Predição (transiente/permanente)	Avaliação da Energia Disponível
busca de ortólogos	sequência completa do genoma de vários organismos	usualmente para complexos obrigatórios mas não transiente	sim
fusão de gene/domínio	sequência completa do genoma de vários organismos/dados de associação de domínio de proteína	bom para interações físicas permanentes, mas não é bom para interações promiscuas de domínios	sim
clusterização de gene e vizinhança de gene	sequência (não necessariamente completa) do genoma de vários organismos	bom para interações funcionais, mas não é bom para interações físicas	-
Acoplamento de resíduo e co-evolução	sequência de aminoácidos de proteínas que interagem	bom para interações físicas e diretas	sim
similaridade de filogenia	sequência (não necessariamente completa) do genoma de vários organismos	bom para interações funcionais e físicas	não
topologia de rede	dados de IPP binários	Para interações funcionais e para interações permanentes e transientes	não
perfil de co-expressão de genes	dados de expressão de gene e ORF	principalmente para interações funcionais	não
docking	estrutura da proteínas	principalmente para interações diretas	sim
Aprendizado de máquina e mineração de texto	diversos tipos de dados, incluindo sequência, estrutura, expressão de gene, literatura	pode ser utilizado para interações funcionais e diretas e para interações transientes e permanentes	sim

Banco de Dados de IPPs

É necessário distinguir bem entre as IPPs experimentais e as IPPs preditas. Na primeira situação, a IPP é provada experimentalmente, enquanto que na segunda a IPP é predita por dados biológicos vindo de outras técnicas, por exemplo de genes correspondentes, o que não prova de fato uma interação de proteína direta. De toda forma, a junção desses diferentes métodos pode trazer mais confiança e acurácia para as redes IPPs sendo geradas. Uma lista com banco de dados e repositórios de IPPs estão descritos na tabela a seguir.

Tabela 2. Lista de Bancos de Dados Organizando IPPs Experimentais e Curadas pela Literatura

Nome	Link Web	Método de Avaliação da Qualidade	Número de Interações	Número de Proteínas
DIP	http://dip.doe-mbi.ucla.edu/	curado	78 191	27 098
MINT	http://mint.bio.uniroma2.it/mint/	curado	241 458	35 553
IntAct	http://www.ebi.ac.uk/intact/	curado	456 489	83 574
HPRD	http://www.hprd.org/	curado	41 327	30 047
BIND	http://bind.ca	curado
MIPS	http://mips.helmholtz-muenchen.de/proj/ppi/	curado
CORUM	http://mips.helmholtz-muenchen.de/genre/proj/corum	um recurso de complexos de proteínas anotados manualmente de organismos mamíferos
BioGRID	http://thebiogrid.org/	interações de proteínas e genéticas curadas por publicações	345 577	53 561
Banco de Dados de Interatômica CCSB	http://interactome.dfci.harvard.edu/	Y2H de larga escala, não curado	4 303	13 944
InWeb	http://www.broadinstitute.org/mpg/dapple/dapple.php	não curado, nota de confiança	428 430	12 793
STRING	http://string-db.org/	não curado, nota de confiança		>5 milhões
MiMI	http://mimi.ncibi.org/MimiWeb/AboutPage.html	avaliação e nota da qualidade	3.5 milhões	3.7 milhões
HIPPIE	http://cbdm.mdc-berlin.de/tools/hippie/information.php	avaliação e nota da qualidade	72 916	11 836
iRefWeb	http://wodaklab.org/iRefWeb	avaliação e nota da qualidade	∼18 000 (para humanos)	∼222 098 (para humanos)
HitPredict	http://hintdb.hgc.jp/htp/	avaliação e nota da qualidade	176 983	36 930
IMID	www.integrativebiology.org	avaliação e nota da qualidade
HAPPI	http://discern.uits.iu.edu:8340/HAPPI/	avaliação e nota da qualidade	2 922 202	32 125
HUPO	http://www.psidev.info/groups/molecular-interactions	avaliação e nota da qualidade
Pathway Databases
KEGG	http://www.kegg.jp/	curado
BioCarta	http://www.biocarta.com/genes/index.asp
Reactome	http://www.reactome.org/	curado	7 041 (em humanos)	7 460(em humanos)
ConsensusPathDB	http://consensuspathdb.org/		416 872	154 537
SPIKE	http://www.cs.tau.ac.il/~spike/	curado	20 412	34 338
NCI-PID	http://pid.nci.nih.gov/index.shtml	curado	9 248

Rede IPP

Topologia de Escala Livre

Por muito tempo acreditava-se que as redes complexas tinham seus componentes (nós) conectados de forma aleatória. Porém isso implicaria na maioria dos nós tendo o mesmo número de conexões. Em contrapartida, estudos do início do século XXI em redes reais demonstraram que muitas delas são dominadas por poucos nós com muitas conexões, denominados "hubs", e muitos nós com poucas conexões. Essa característica representa a topologia de escala livre (do inglês scale-free) presente em diversas redes reais, na qual o número de nós com k conexões segue uma distribuição de lei de potência, P(k) = k^-γ, onde γ é o grau do expoente. A natureza heterogênea da topologia de redes de escala livre tem consequências importantes na tolerância a erros e robustez das redes celulares, e também foi detectada em redes IPPs. Tipicamente para rede IPPs 2 < γ < 3.

É bastante controverso se a natureza de escala livre das redes IPPs não é apenas um artefato da incompletude dos banco de dados existentes, cuja origem está na ausência de potenciais interações e na presença de falso positivos. O estudo extenso em redes de escala livre indicam que isso é improvável pois uma amostragem aleatória de uma rede de escala livre também é uma rede de escala livre, o que é impossível de acontecer se a amostragem fosse feita em uma rede sem essa topologia.

Muitas investigações propuseram que a natureza de escala livre observada nas redes IPPs pode ser resultado da duplicação de gene, um processo que ocorre frequentemente na evolução. Cada evento de duplicação de gene leva a uma nova proteína que interage com as mesma proteínas que a proteína produto do gene original duplicado (característica de crescimento da rede). Proteínas que possuem muitas conexões possuem mais chances de serem conectadas a um gene duplicante, e logo, ganhar novas interações com a nova proteína criada (característica de ligação preferencial, proteínas com muitas conexões aumentam suas interações mais rápido do que aquelas com poucas conexões - fenômeno rico fica mais rico). Esses dois ingredientes resultantes da duplicação de genes, o crescimento e a ligação preferencial, são os ingredientes necessários para o surgimento de uma rede de escala livre, e fortalecem a hipótese de que as redes IPPs têm de fato essa topologia.

Modularidade

Modularidade assume a existência de complexos de proteínas que são grupos de proteínas que trabalham juntas para alcançar alguma função biológica bem definida ou estão envolvidas no mesmo processo biológico. Da perspectiva da rede esses módulos deveriam aparecer como grupos distintos de nós que são muito interconectados entre si mas que possuem apenas poucas ligações com nós fora do modulo, sendo que os hubs exercem um importante papel em interconectar tais módulos. Em 2004 foi evidenciado que redes IPPs apresentam um alto grau de modularidade com uma organização hierárquica, caracterizada por um coeficiente de clusterização dependente do grau de cada nó dado por C(k) ≈ k^-β, onde beta é o expoente de modularidade que caracteriza a modularidade hierárquica da rede. O coeficiente de clusterização C_i de um nó i mede a fração de conexões entre os nós da sua vizinhança (conjunto de todos os nós diretamente ligados a i). Foi encontrado β ≈ 2 para as rede IPPs analisadas. Uma observação interessante é que complexos de proteínas são geralmente evolutivamente conservados, e foi observado que tais módulos podem ser encontrados em diferentes organismos com padrões de interação idênticos ou similares, tais como entre levedura e mosca e entre humanos e mosca. Além disso, essa modularidade também pode representar em um certo grau proteínas pertencentes a diferentes localizações celulares.

Proteins-are-grouped-based-on-their-subcellular-location-in-the-network-of-the-human-plasma-membrane-peripheral-proteins

Propriedade de Mundo Pequeno

Outra propriedade importante das redes de interação de proteínas atuais é a fragmentação da rede em muitos clusters distintos, caracterizada pela presença de um cluster gigante que engloba uma fração significativa dos nós e diversos clusters menores ou nós isolados (proteínas que não possuem interações conhecidas). Nesse contexto de ciência de redes um cluster, também chamado de componente, é um conjunto de nós que estão interligados, ou seja, existe um caminho passando pelas conexões desses nós que permitir sair de um nó e chegar a qualquer outro nó do mesmo cluster. Essa fragmentação pode ser um indicativo de que os banco de dados existentes contém apenas uma fração de todas as IPPs presentes nos organismos estudados. De fato, se mais interações de proteínas forem descobertas, é esperado que o cluster gigante absorva uma grande fração de todas as proteínas, e uma rede de proteínas totalmente conectada poderia surgir com um único componente gigante. O cluster gigante das redes IPPs é tipicamente muito interconectado, o que resulta em uma distância nó-a-nó (ou diâmetro) pequena. Esse diâmetro pequeno é um indicativo de que as redes de interação de proteínas têm a propriedade de mundo pequeno, o que significa que a distância média nó-a-nó na rede é pequena. De fato, analisando esse cluster gigante para 4 diferentes bancos de dados de IPPs mostrou que a distância média nó-a-nó variou de 4 a 8.

Large-scale characteristics of four protein interaction databases, shown on a log-log plot. (a) Degree distribution. (b) Distribution of the clustering coefficient. (c) Cluster size distribution

Discussão

As redes IPP podem fornecer uma visão complementar para os processos biológicas que englobam as proteínas correspondentes. Para o futuro dessa área e para os provedores de banco de dados restam dois desafios: (1) um filtro melhor de falsos positivos em coleções de IPP; e (2) uma distinção adequada do contexto biológico que especifica e determina a existência ou não de uma dada IPP em uma dada situação biológica. Apesar de existirem muitos esforços para construir a interatômica em escala proteômica, a incerteza e falta de definição clara de uma interatômica dificultam o processo. Além disso, considerar a característica dinâmica, os compartimentos celulares, a estabilidade, a afinidade e dependência do tempo da interações de proteína é o objetivo final para ganhar mais informações sobre os mecanismos celulares por baixo das redes IPPs.