RT-LAMP

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A amplificação isotérmica mediada por alça com transcrição reversa (do inglês, Reverse transcription loop-mediated isothermal amplification, RT-LAMP) é uma técnica para a amplificação de RNA.

O método LAMP é utilizado para detecção de patógenos, tumores e identificação de sexo de embriões, entre outras aplicações.[1] A combinação do LAMP com uma fase de transcrição reversa permite de RNAs nas amostras. O RT-LAMP é um método de amplificação de ácido nucleico usado para diagnosticar doenças infecciosas causadas por bactérias ou vírus.[2]

O método de PCR é capaz de gerar milhões de cópias de uma cadeia alvo de DNA. Esse processo depende de ciclos de aquecimento e resfriamento para a replicação do DNA. O RT-LAMP não requer esses ciclos e é realizado a uma temperatura constante entre 60 e 65° C. Semelhante ao RT-PCR, o RT-LAMP usa a transcriptase reversa para sintetizar DNA complementar (cDNA) a partir de seqüências de RNA. Este cDNA é então amplificado usando DNA polimerase, gerando 10^9 cópias por hora.[3]

Aplicações[editar | editar código-fonte]

Os vírus infectam as células hospedeiras e o RT-LAMP é usado para testar uma sequência específica desse vírus, que não é encontrada em outros vírus conhecidos.

Um exemplo do uso RT-LAMP foi um experimento para detectar um novo vírus de pato.[4][5] Como os sintomas desse vírus eram semelhantes para Tembusu, uma doença já identificada, a sequência nucleotídica do genoma completo desse vírus estava disponível em recursos externos. A sequência conhecida foi colocada no software de criação de primers online, LAMP Primer Explorer (http://primerexplorer.jp/e/ ), onde os primers apropriados foram projetados e selecionados. Com os iniciadores selecionados, foi realizado um ensaio de RT-LAMP para amplificar o RNA, com o qual as amostras poderiam ser visualizadas e confirmadas sob luz natural e UV.[2]


O RT-LAMP está sendo usado para diagnósticos do vírus da COVID-19 no Brasil.[6][7][8]

Detecção do novo coronavírus (SARS-CoV-2) da COVID-19[editar | editar código-fonte]

Na China, em dezembro de 2019, foram identificados vários casos de pneumonia de causa desconhecida, relacionados a um mercado de frutos-do-mar na cidade de Wuhan. Essa nova doença causada por um coronavírus, SARS-CoV-2,  recebeu o nome COVID-19.

Nos primeiros meses da pandemia do novo coronavírus, os testes baseados em RT-PCR (Reação em cadeia da polimerase com transcriptase reversa) foram considerados padrão-ouro para o diagnóstico de COVID-19. Porém vários gargalos dificultam a aplicação do teste de RT-PCR em larga escala, principalmente no Brasil e nos Estados Unidos[9]: falta de kits de coleta e de reagentes, quantidade insuficiente de equipamentos de PCR em tempo real, alto custo e prazo de entrega superior a 24 horas.

Assim como o RT-PCR, a amplificação isotérmica mediada por loop (RT-LAMP) é uma técnica de biologia molecular que consegue identificar o RNA do vírus SARS-CoV-2  em uma pessoa infectada apenas alguns dias após o início da infecção. A detecção do vírus pode ser feita a partir de amostra nasofaríngea ou de saliva.

Além do protocolo ser mais simples e rápido do que o RT-PCR, o RT-LAMP não requer o uso de aparelhos laboratoriais complexos, como termociclador em tempo real ou de reagentes em falta na pandemia.

Desde abril de 2020, vários artigos publicados por grupos de pesquisa no mundo todo mostraram a eficiência da técnica de RT-LAMP como estratégia alternativa ao RT-PCR para detecção SARS-CoV-2.[10][11][12][13][14][15][16][17][18][19][20] O primeiro teste comercial para COVID-19 baseado em RT-LAMP foi disponibilizado em abril pelo Laboratório americano Color Genomics.[21] O teste recebeu aprovação do agência federal americana FDA (U.S. Food and Drug Administration).[22]  

Testes de RT-LAMP para  COVID-19 no Brasil[editar | editar código-fonte]

Em abril de 2020, pesquisadores da Fiocruz em parceria com a empresa Visuri adaptaram o OmniLAMP, um dispositivo portátil que realiza testes moleculares por RT-LAMP, para o diagnóstico da COVID-19.[23][24][25][26][27] A tecnologia foi inicialmente concebida em 2018 para o diagnóstico de arboviroses e em 2020 recebeu o prêmio Abril & Dasa de inovação médica, como destaque no enfrentamento à pandemia de COVID-19.

Em junho de 2020, o laboratório Mendelics desenvolveu o primeiro teste de RT-LAMP para COVID-19 na América Latina: o #PARECOVID. O teste identifica a presença do vírus SARS-CoV-2 em amostra de saliva.[28][29][30]

Em março de 2021, a empresa Labtest obteve o registro do produto OmniLAMP SARS-CoV-2 junto à Agência Nacional de Vigilância Sanitária - ANVISA, sendo a primeira solução para o diagnóstico da COVID-19 por RT-LAMP (registro n°:10009010368). Em abril de 2021, a mesma empresa registrou o Mytest, um kit de auto-coleta de saliva que funcionam com o sistema OmniLAMP na descentralização dos testes de RT-LAMP para o diagnóstico da COVID-19.

Pesquisadores do Instituto de Biociências da Universidade de São Paulo (IB-USP) e da Universidade Federal de Goiás (UFG) estão atualmente também desenvolvendo testes para detecção em larga escala do SARS-CoV-2 baseado em RT-LAMP.[31][32]

A técnica de RT-LAMP para o diagnóstico da COVID-19 é capaz de detectar as novas variantes do SARS-CoV-2 que circulam no Brasil.[8]

Já existem iniciativas também para produzir reagentes do RT-LAMP no Brasil e assim internalizar a produção de insumos que hoje são importados.[33]

Referências

  1. ↑ «Applications of loop-mediated isothermal DNA amplification». Appl. Biochem. Biotechnol. 163: 845–50. 2011. PMID 20844984. doi:10.1007/s12010-010-9088-8 
  2. ↑ a b «Loop-mediated isothermal amplification (LAMP): a rapid, accurate, and cost-effective diagnostic method for infectious diseases». J. Infect. Chemother. 15: 62–9. 2009. PMC 7087713Acessível livremente. PMID 19396514. doi:10.1007/s10156-009-0669-9 
  3. ↑ «Loop-mediated isothermal amplification of DNA». Nucleic Acids Res. 28: 63e–63. 2000. PMC 102748Acessível livremente. PMID 10871386. doi:10.1093/nar/28.12.e63 
  4. ↑ «Transmission dynamics of the recently-identified BYD virus causing duck egg-drop syndrome». PLOS ONE. 7: e35161. 2012. Bibcode:2012PLoSO...735161V. PMC 3329443Acessível livremente. PMID 22529985. doi:10.1371/journal.pone.0035161 
  5. ↑ «Development of RT-LAMP and real-time RT-PCR assays for the rapid detection of the new duck Tembusu-like BYD virus». Arch. Virol. 157: 2273–80. PMID 22865206. doi:10.1007/s00705-012-1431-7 
  6. ↑ «A corrida por um teste molecular rápido | Revista Pesquisa Fapesp». revistapesquisa.fapesp.br. Consultado em 6 de julho de 2020 
  7. ↑ «Pesquisadores da USP desenvolvem teste de diagnóstico de COVID-19 pela saliva». AGÊNCIA FAPESP. Consultado em 28 de agosto de 2020 
  8. ↑ a b Alves, Pedro Augusto; Oliveira, Ellen G.; Franco-Luiz, Ana Paula M.; Almeida, Leticia T.; Goncalves, Amanda B.; Borges, Iara A.; Rocha, Flavia S.; Rocha, Raissa P.; Bezerra, Matheus F. (2 de junho de 2021). «Clinical validation of colorimetric RT-LAMP, a fast, highly sensitive and specific COVID-19 molecular diagnostic tool that is robust to detect SARS-CoV-2 variants of concern» (em inglês). doi:10.1101/2021.05.26.21257488. Consultado em 3 de junho de 2021 
  9. ↑ «coronavirus testing supply shortage» 
  10. ↑ Dao Thi, Viet Loan; Herbst, Konrad; Boerner, Kathleen; Meurer, Matthias; Kremer, Lukas PM; Kirrmaier, Daniel; Freistaedter, Andrew; Papagiannidis, Dimitrios; Galmozzi, Carla (12 de agosto de 2020). «A colorimetric RT-LAMP assay and LAMP-sequencing for detecting SARS-CoV-2 RNA in clinical samples». Science Translational Medicine (em inglês) (556): eabc7075. ISSN 1946-6234. PMC 7574920Acessível livremente. PMID 32719001. doi:10.1126/scitranslmed.abc7075. Consultado em 10 de novembro de 2020 
  11. ↑ Lamb, Laura E.; Bartolone, Sarah N.; Ward, Elijah; Chancellor, Michael B. (12 de junho de 2020). «Rapid detection of novel coronavirus/Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus 2 (SARS-CoV-2) by reverse transcription-loop-mediated isothermal amplification». PLOS ONE (6): e0234682. ISSN 1932-6203. doi:10.1371/journal.pone.0234682. Consultado em 10 de novembro de 2020 
  12. ↑ Baek, Yun Hee; Um, Jihye; Antigua, Khristine Joy C.; Park, Ji-Hyun; Kim, Yeonjae; Oh, Sol; Kim, Young-il; Choi, Won-Suk; Kim, Seong Gyu (1 de janeiro de 2020). «Development of a reverse transcription-loop-mediated isothermal amplification as a rapid early-detection method for novel SARS-CoV-2». Emerging Microbes & Infections (em inglês) (1): 998–1007. ISSN 2222-1751. doi:10.1080/22221751.2020.1756698. Consultado em 10 de novembro de 2020 
  13. ↑ Yan, C.; Cui, J.; Huang, L.; Du, B.; Chen, L.; Xue, G.; Li, S.; Zhang, W.; Zhao, L. (junho de 2020). «Rapid and visual detection of 2019 novel coronavirus (SARS-CoV-2) by a reverse transcription loop-mediated isothermal amplification assay». Clinical Microbiology and Infection (6): 773–779. ISSN 1198-743X. PMC 7144850Acessível livremente. PMID 32276116. doi:10.1016/j.cmi.2020.04.001. Consultado em 10 de novembro de 2020 
  14. ↑ Jiang, Minghua; Pan, Weihua; Arastehfar, Amir; Fang, Wenjie; ling, Liyan; Fang, Hua; Farnaz Daneshnia, Farnaz; Yu, Jian; Liao, Wanqing (20 de março de 2020). «Development and validation of a rapid single-step reverse transcriptase loop-mediated isothermal amplification (RT-LAMP) system potentially to be used for reliable and high-throughput screening of COVID-19». dx.doi.org. Consultado em 10 de novembro de 2020 
  15. ↑ Lu, Renfei; Wu, Xiuming; Wan, Zhenzhou; Li, Yingxue; Jin, Xia; Zhang, Chiyu (18 de abril de 2020). «A Novel Reverse Transcription Loop-Mediated Isothermal Amplification Method for Rapid Detection of SARS-CoV-2». International Journal of Molecular Sciences (8). 2826 páginas. ISSN 1422-0067. doi:10.3390/ijms21082826. Consultado em 10 de novembro de 2020 
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  17. ↑ Park, Gun-Soo; Ku, Keunbon; Baek, Seung-Hwa; Kim, Seong-Jun; Kim, Seung Il; Kim, Bum-Tae; Maeng, Jin-Soo (junho de 2020). «Development of Reverse Transcription Loop-Mediated Isothermal Amplification Assays Targeting Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus 2 (SARS-CoV-2)». The Journal of Molecular Diagnostics (6): 729–735. ISSN 1525-1578. doi:10.1016/j.jmoldx.2020.03.006. Consultado em 10 de novembro de 2020 
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  21. ↑ «COVID-19 Testing & Surveillance for Large Populations». Color (em inglês). Consultado em 10 de novembro de 2020 
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  24. ↑ Minas, Estado de; Minas, Estado de (2 de setembro de 2020). [https://www.em.com.br/app/noticia/nacional/2020/09/02/interna_nacional,1181872/novo-metodo-pode-popularizar-teste-molecular-para-detectar-coronavirus.shtml «Dispositivo port�til pode popularizar teste molecular para detec��o do coronav�rus»]. Estado de Minas. Consultado em 3 de junho de 2021  replacement character character in |titulo= at position 17 (ajuda)
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  27. ↑ «Dispositivo portátil pode realizar teste da covid-19 com menor custo» 
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  29. ↑ «Novo teste de saliva para COVID-19» 
  30. ↑ «#PARECOVID» 
  31. ↑ https://jornal.ufg.br/n/127896-ufg-desenvolve-teste-molecular-rapido-para-covid-19-em-microchips  Em falta ou vazio |título= (ajuda)
  32. ↑ https://agencia.fapesp.br/pesquisadores-da-usp-desenvolvem-teste-de-diagnostico-de-covid-19-pela-saliva/33998/  Em falta ou vazio |título= (ajuda)
  33. ↑ https://www.educacao.sp.gov.br/noticias/centro-da-unicamp-produzira-enzimas-para-teste-de-saliva-para-covid-19/  Em falta ou vazio |título= (ajuda)

Ligações externas[editar | editar código-fonte]

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