Sequenciamento de DNA

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Máquinas que realizam o sequenciamento de DNA

O sequenciamento de DNA (português brasileiro) ou sequenciação de ADN (português europeu) é uma série de métodos bioquímicos que têm como finalidade determinar a ordem das bases nitrogenadas adenina (A), guanina (G), citosina (C) e timina (T) da molécula de DNA.

A montagem do genoma é feito através da união de um grande número de sequências de DNA que são juntadas para criar uma representação do cromossomo original do DNA em estudo. Em um projeto de sequenciamento shotgun, todo o DNA do ser vivo analisado (seja uma bactéria, seja um mamífero) é inicialmente particionado em milhões de pequenos pedaços. Estes pedaços são então "lidos" por máquinas de sequenciamento automático, capazes de ler até 1000 nucleotídeos ou bases de uma só vez. Um algoritmo de montagem de genoma é então utilizado para reunir todas as partes e colocá-las na ordem original, detectando todos os locais onde existe coincidências entre pedaços distintos de DNA. As partes coincidentes podem ser fundidas, unindo dois pedaços de DNA. O processo é repetido até montar a sequência completa. O sequenciamento é um processo computacional difícil pois vários genomas possuem um grande número de sequências idênticas, às vezes com milhares de nucleotídeos, algumas ocorrendo em milhares de locais diferentes.

A BASF, maior produtora de produtos químicos do mundo, com sede na Alemanha, registrou 47% de todas as seqüências marinhas patenteadas..[1]

Métodos de sequenciamento[editar | editar código-fonte]

Método de Sanger[editar | editar código-fonte]

O método de Sanger, também chamado de método de terminação em cadeia, é uma técnica que utiliza a DNA- polimerase I de Escherichia coli para sintetizar cópias complementares do DNA de fita simples a ser sequenciado.

O método de Sanger envolve a produção de muitas cópias de DNA e tem como componentes, além do DNA molde a ser sequenciado, uma enzima DNA polimerase, um par de oligonucleotídeos iniciadores (primers senso e antisenso) e os quatro nucleotídeos do DNA ou desoxirribonucleosídeos trifosfatados (dATP, dTTP, dCTP, dGTP). Além disso, como característica peculiar do Método de Sanger são adicionados à mistura de reagentes versões terminadores de cadeia, os didesoxinucleosídeos trifosfatados (ddTNPs) para os quatro nucleotídeos de cadeia existentes (ddATP, ddCTP, ddGTP e ddTTP), cada um marcado com um corante de uma cor diferente.

Ocorre que durante a execução da técnica, quando o análogo didesóxi é incorporado ao polinucleotídeo em crescimento no lugar do nucleotídeo normal correspondente, o crescimento da cadeia é terminado devido a ausência de um grupo 3-OH, o que impede a formação de uma nova ligação fosfodiéster. Ao se usar somente uma pequena quantidade de ddNTP, uma série de cadeias truncadas é gerada, cada uma tendo sido terminada pelo análogo didesóxi em uma das posições ocupadas pela base correspondente. São feitas reações para cada um dos quatro ddNTPs e as quatro misturas das reações são separadas, simultaneamente, por eletroforese em canaletas paralelas em um gel de sequenciamento (gel de poliacrilamida fina preparado com aproximadamente 7M de uréia e a cerca de 70º C, de modo a eliminar associações por ligações de hidrogênio).

Os fragmentos gerados nessas condições são, então, separados por seus tamanhos e sequência do DNA complementar a fita molde pode ser lida diretamente em um autorradiograma do gel de sequenciamento, de baixo para cima, ou seja, do fragmento mais curto (aquele cuja interrupção do alongamento ocorreu no início da cadeia, portanto, correspondente às porções iniciais da mesma) para o mais longo (correspondente às porções finais). Em um único gel é possível resolver não mais que 300 a 400 fragmentos consecutivos através do auxílio de instrumentos computadorizados.[2]

Método de Sanger automatizado[editar | editar código-fonte]

     Para sequenciar grandes extensões de DNA, o método de Sanger pode ser acelerado através da automação. Isso exigiu que as técnicas de marcação radioativa descritas anteriormente, que não são facilmente automatizadas, fossem substituídas por técnicas de marcação fluorescente (eliminando danos à saúde e problemas de armazenamento decorrentes do uso de nucleotídeos radioativos).

Na mais usada dessas técnicas, cada um dos quatro ddNTPs usados para terminar a extensão de cadeia é ligado covalentemente a um marcador fluorescente de cor diferente e as reações de extensão de cadeia são realizadas em um único tubo que contém os quatro ddNTPs marcados. A mistura de fragmentos formados é, então, submetida à eletroforese em uma 'única canaleta do gel de sequenciamento e a medida que cada fragmento sai do gel, sua base terminal é identificada de acordo com o seu espectro de fluorescência, que é característico para cada base, por um sistema de detecção de fluorescência induzido por laser. Os detectores de fluorescência usados nesses instrumentos são controlados por computador, e a aquisição de dados é, portanto, automatizada.

Nos sistemas mais avançados, o gel de sequenciamento está contido em um conjunto de até 96 capilares, em vez de uma placa de gel; a preparação e a aplicação da amostra são realizadas por sistemas robotizados; e a eletroforese e a análise dos dados são completamente automatizadas. Esses sistemas podem sequenciar simultaneamente 96 amostras de DNA, cerca de 650 bases por hora.[3]

Pirosequenciamento[editar | editar código-fonte]

O pirosequenciamento é um sistema de sequenciamento de segunda geração. É o sistema utilizado pela plataforma 454 Life Sciences.[4] A metodologia é capaz de determinar qual das quatro bases foi incorporada na cópia do DNA molde. Essa técnica é utilizada no sequenciamento de novo (sequenciamento de genomas desconhecidos) principalmente para elucidação de genomas bacterianos. O sistema é dividido em três etapas: preparo da amostra, PCR em emulsão e o sequenciamento.[5]

Preparo da Amostra

O DNA é clivado em fragmentos aleatórios e pequenos de 300-500pb e são então ligados a adaptadores que possuem uma sequência específica que permite a ligação desse fragmento a microesferas de captura de DNA.

PCR em emulsão

As microesferas são ressuspendidas em uma mistura de reagentes de PCR, água, dNTPs, oligonucleotídeos iniciadores e Taq DNA-polimerase para a amplificação do fragmento. Cada gotícula possui uma microesfera, assim funcionando como um microrreator sem contaminantes ou sequências competidoras. Após a PCR, as microesferas com os seus respectivos fragmentos são depositadas em uma placa onde cada poço possui apenas uma microesfera. A placa do sequenciamento contém 1,6 milhões de poços.

Sequenciamento

O DNA é sequenciado em ciclos, e a cada ciclo um nucleotídeo é adicionado à reação. Se o nucleotídeo conhecido adicionado for incorporado à sequência um sinal de luz é emitido.

           Um dos quatro dNTPs é adicionado ao poço, se o dNTP for complementar ao DNA molde e incorporado à sequencia a DNA polimerase cataliza a sua inserção e libera um íon pirofosfato.

DNA n resíduos + dNTP → DNA n+1 resíduos + P2O74-

           A adenosina-5´-fosfossulfato adicionada reage com o pirofosfato para formar ATP, essa reação é catalizada pela enzima ATP-sulfurilase.

P2O74- + Adenosina-5´-fosfossulfato → ATP + SO42-

           O ATP formado mais a luciferina e O2 produz oxiluciferina e um facho de luz visível, quimioluminescência. A quantidade de nucleotídeos adicionados é proporcional à intensidade da luz detectada, assim é possível determinar o número de nucleotídeos adicionados.

ATP + Luciferina → Luz + Oxiluciferina

           A última etapa é a de lavagem onde  a apirase é adicionada ao poço para a degradação de nucleotídeos que não reagiram.

NTP + 2H2O→ NMP + 2PO43-

Sequenciamento por síntese[editar | editar código-fonte]

O sequenciamento por síntese, assim como o sequenciamento de Sanger, faz uso de DNA polimerase e nucleotídeos terminadores marcados com diferentes fluoróforos. É o tipo de sequenciamento utilizado pela plataforma Illumina. A inovação dessa técnica consiste na clonagem in vitro dos fragmentos a serem sequenciados, em uma plataforma sólida de vidro, processo também conhecido como PCR de fase sólida. [6] [7]O que proporciona um sequenciamento em ampla escala com maior rapidez e precisão. Essa técnica é dividida em 3 etapas, a preparação da amostra, o cluster (formação de grupos de fragmentos na placa) e o sequenciamento.

Na etapa de preparação, o fragmento de DNA da amostra a ser sequenciado é ligado a sequencias adaptadoras em suas extremidades. Esses adaptadores são semelhantes a adaptadores que são fixados previamente a superfície da placa de clonagem, por sua extremidade 5’, de modo a deixar a extremidade 3’ livre para o sequenciamento.

Já na etapa de cluster, os fragmentos de DNA são hibridizados através dos seus adaptadores em suas extremidades aos adaptadores previamente fixados na placa, o que promove uma grande estabilidade a sequência e um bom acesso as enzimas. Essa hibridização é seguida de uma etapa de amplificação, onde são disponibilizados dNTPs não marcados, para que seja sintetizada a fita complementar dos fragmentos de DNA imobilizados na placa, formando assim os clusters de fragmentos a serem sequenciados.

 Já na terceira etapa, o sequenciamento propriamente dito, 4 diferentes nucleotídeos terminadores marcados são fornecidos para as reações de sequenciamento que ocorrem dentro de cada cluster. A cada ciclo de sequenciamento apenas 1 nucleotídeo marcado é disponibilizado, porém a alta densidade dos clusters de sequenciamento possibilita que o sinal de fluorescência gerado com a incorporação de cada um dos nucleotídeos terminadores tenha uma intensidade suficiente para garantir sua detecção exata. A leitura do sinal de fluorescência é realizada ao término de cada ciclo. Em seguida, ocorre uma etapa de lavagem para remoção dos reagentes excedentes, remoção do terminal 3’ bloqueado e do fluoróforo do nucleotídeo incorporado no ciclo anterior para dar continuidade ao sequenciamento. A leitura das bases é feita pela análise sequencial das imagens capturadas em cada ciclo de sequenciamento.[8] O resultado final é um sequenciamento base-por-base altamente preciso.

Sequenciamento de Nova Geração (NGS)[editar | editar código-fonte]

O projeto do genoma humano, a necessidade de obter informações genéticas para medicina personalizada, o avanço da tecnologia e outras demandas impulsionaram o desenvolvimento de novas metodologias de sequenciamento com melhor qualidade, menor custo, maior rapidez e maior capacidade de geração de informações.[9] Esses novos métodos pertencem ao grupo de Sequenciamento de Nova Geração (NGS, do inglês Next-Generation Sequencing), podendo ser de segunda, terceira ou quarta geração.[10] Dentre esses métodos, destacam-se o 454 Roche (pirossequeciamento), o Illumina, o Ion-torrent, o PacBio e o Nanopore.

Segunda geração[editar | editar código-fonte]

Na maioria dos sequenciamentos, parte-se do princípio que a DNA polimerase irá adicionar nucleotídeos em uma fita de DNA complementar a uma fita molde. A identificação da ordem de quais nucleotídeos estão sendo incorporados permite o conhecimento da sequência da molécula em questão. A reação de adição de um nucleotídeo à molécula de DNA naturalmente causa liberação de H+ e, consequentemente, uma alteração no pH e na condutividade. No método Ion Torrent, vários segmentos de DNA a serem sequenciados estão dispostos em um chip contendo um sensor que detecta essa variação no pH e uma DNA polimerase. Um tipo de nucleotídeo (A, T, C ou G) é fornecido por vez ao chip. Se o segmento de DNA possui determinado nucleotídeo em sua sequência, nessa posição, ele será incorporado e a mudança de pH será detectada, do contrário, não ocorrerá reação de incorporação e nenhuma alteração é detectada. Assim é possível saber qual nucleotídeo foi adicionado. Ciclos de fornecimento de A, T, C e G são constantemente repetidos até que todos os segmentos tenham suas fitas complementares formadas e a sequência obtida. Devido a essa detecção direta, Ion Torrent é um método de sequenciamento bastante rápido. [11]

Outros sequenciamentos de segunda geração são: 454 Roche e Illumina.

Terceira geração[editar | editar código-fonte]

O método de PacBio utiliza uma única molécula de DNA de fita simples que é submetida a replicação por DNA polimerase imobilizada em um micro poço. Durante a replicação, são utilizados nucleotídeos marcados com fluoróforos de diferentes cores. A medida que os nucleotídeos vão sendo incorporados, os fluoróforos são liberados, causando emissão de luz em um comprimento de onda específico. A luz é detectada, e como a adição de cada nucleotídeo resulta em uma fluorescência diferente, é possível identificar a ordem de adição dos nucleotídeos e, portanto, obter a sequência da molécula de DNA. PacBio é considerado uma metodologia de alta acurácia. [12]

Quarta geração[editar | editar código-fonte]

O NanoPore é um dos métodos de sequenciamento mais recentes e oferece diversas vantagens. O sequenciamento é realizado em um dispositivo portátil e pequeno, que contém uma entrada USB que permite o carregamento dos dados a qualquer momento. Não há incorporação de nucleotídeos nessa metodologia e a sua praticidade permite que sequenciamentos sejam realizados de maneira rápida em qualquer ambiente sem a necessidade de muitos recursos. Nessa metodologia, uma única fita da molécula de DNA é induzida a passar por um nano poro presente em uma membrana. A cada base nucleotídica constituinte da molécula que passa pelo poro, é detectada uma alteração na amperagem, que será característica de cada base, permitindo o sequenciamento.  [13]

Referências[editar | editar código-fonte]

  1. «One Corporation Holds Most of Ocean's Genetic Patents». AAAS - The World's Largest General Scientific Society (em inglês). 6 de junho de 2018 
  2. Fishman, A.; Isikoff, M. B.; Barkin, J. S.; Friedland, J. T. (August 1979). «Significance of a dilated pancreatic duct on CT examination». AJR. American journal of roentgenology. 133 (2): 225–227. ISSN 0361-803X. PMID 110084. doi:10.2214/ajr.133.2.225  Verifique data em: |data= (ajuda)
  3. Smith, L. M.; Sanders, J. Z.; Kaiser, R. J.; Hughes, P.; Dodd, C.; Connell, C. R.; Heiner, C.; Kent, S. B.; Hood, L. E. (1986 Jun 12-18). «Fluorescence detection in automated DNA sequence analysis». Nature. 321 (6071): 674–679. ISSN 0028-0836. PMID 3713851. doi:10.1038/321674a0  Verifique data em: |data= (ajuda)
  4. VOET, Donald; VOET, Judith. Bioquímica. Porto Alegre: Artmed, 2013.
  5. CARVALHO, Mayra Costa da Cruz Gallo de; SILVA, Danielle Cristina Gregorio da. Sequenciamento de DNA de nova geração e suas aplicações na genômica de plantas. Ciência Rural, [s.l.], v. 40, n. 3, p.735-744, mar. 2010. FapUNIFESP (SciELO). http://dx.doi.org/10.1590/s0103-84782010000300040.
  6. FEDURCO, M. et al. BTA, a novel reagent for DNA attachment on glass and efficient generation of solid-phase amplified DNA colonies. Nucleic acids research, v.34, n.3, p.e22, 2006.
  7. TURCATTI, G. et al. A new class of cleavable fluorescent nucleotides: synthesis and optimization as reversible terminators for DNA sequencing by synthesis. Nucleic acids research, v.36, e25, 2008.
  8. SHENDURE, J.; JI, H. Next-generation DNA sequencing. Nature biotechnology, v.26, n.10, p.1135-1145, 2008.
  9. THERMO FISHER SCIENTIFIC. Next-Generation Sequencing (NGS). Disponível em: <https://www.thermofisher.com/br/en/home/life-science/sequencing/next-generation-sequencing.html>. Acesso em: 10 abr. 2018.
  10. MARTINS, Cesar. The next generation sequencing. Botucatu: Unesp, 2013. Color.
  11. LIFE TECHNOLOGIES. Ion Torrent Amplicon Sequencing. Disponível em: <http://www3.appliedbiosystems.com/cms/groups/applied_markets_marketing/documents/generaldocuments/cms_094273.pdf>. Acesso em: 10 abr. 2018.
  12. PACBIO. Smart Sequencing. Disponível em: <https://www.pacb.com/smrt-science/smrt-sequencing/>. Acesso em: 10 abr. 2018.
  13. OXFORD NANOPORE TECHNOLOGIES. DNA: nanopore sequencing. Disponível em: <https://nanoporetech.com/applications/dna-nanopore-sequencing>. Acesso em: 10 abr. 2018.
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