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Detecção de Salmonella em Alimentos

Salmonella é um risco em potencial para o consumidor, cuja disseminação é facilitada, na atualidade, pela mudança nos hábitos alimentares da população. A necessidade de elevar a produção de alimentos que muitas vezes não leva em consideração as boas práticas de fabricação (BPF) que são normas a serem seguidas por um estabelecimento para garantir a fabricação de alimentos seguros que não coloquem em risco a saúde do consumidor, que incluiem desde cuidados com a matéria-prima, fabricação, o armazenamento, transporte até o consumo final.

A metodologia para a detecção de Salmonella spp. em alimentos é diferente das realizadas em laboratórios clínicos. E na sua metodologia requer algumas etapas a serem seguidas até a confirmação em testes bioquímicos.

Pré-enriquecimento

O pré-enriquecimento é uma etapa de recuperação das células da salmonellas que por sua vez, podem estar presente em um alimento mas em pequenas quantidades e que durante o processo de fabricação de um alimento podem ter sofrido enjurias como alta temperatura e assim perdendo suas funções celulares, então, há a necessidade de recuperação das células em meios de cultura não seletivos. Os danos causados em alguma etapa do processamento só pode ser revesíveis se oferecer condicções favoráveis as células tais como a inoculadas em meios não seletivos ricos em nutrientes como a água peptonada tamponada, caldo lactosado, dentre outros. Nessa etapa não se pode utilizar um agente seleivo devido as células não sobreviverem ou perderem sua capacidade de profliferação.

Os meios utilizados no pré-enriquecimento devem estar em uma faixa de pH entre (3, 4-, 7, 0) e suas variações e a temeperatura de incubação entre 37ºC com 1ºC de variação por um tempo de 16-24 horas. Nessa etapa também se pode acrescentar reagentes que inibem o desenvolvimento de microbiota acompanhante da salmonella como o verde brilhante, o tretationado e bile.

Enriquecimento seletivo

Essa etapa favorece a proliferação das células viáveis de Salmonella e juntamente com a microbiota acompanhante se não for acrescentado inibidores da salmonella durante a etapa de enriquecimento. Na seletividade utiliza-se uma temperatura 41, 5ºC com variação de 1ºC por um tempo de 18-24 horas e os meios podem ser o Caldo Rappaport Vassiliadis Soja (RVS), o caldo Tretationato, dentre outos. Geralmente são utilizados dois tipos de caldo seletivo devido a resistência da salmonella aos agentes seletivos. A seletividade do RVS é baseada na sua composição que há a presença do verde de mlaquita oxalato e no pH ácido (5,1), o Tretrationato possue varias formulações e a seletividade está na presença de verde brilhante, bile, iodo e Tiossulfato de sódio. A adição do iodo ao caldo Tretrationato deve ser no momento da realização da análise pois ele reage com o tiossulfato para formar o tretrationato.

Isolamento em meio Seletivo (plaqueamento)

Essa etapa é de suma importância para a diferenciação de outros grupos de bactérias, pois o objetivo é isolar Salmonella em meios sólidos que contenham propriedades inibitórias . Os meios sólidos são baseados na inacapacidade de muitas Salmonellas de não serem fermentadoras de lactose e em alguns casos, como a sacarose e bem como a capacidade de produção de Sulfeto de Hidrogênio.

Vários meios podem serem empregados para essa etapa como o Ágar Entérico de Hectoen (HE), o Ágar Xilose Lisina Desoxicolato (XLD) , e essa escolha depende do procedimento do laboratório em questão. O isolamento consiste em retirar uma alíquota de meios seletivos e estriar com alça de inóculação estéril em placas de petri conténdo os meios da preferência do laboratório e incubar a uma temperatura de 37º C por 24 horas. Os meios mais utilizados são os que diferenciam Salmonellas através da não fermentação da lactose e da produção de Sulfeto de Hidrogênio, como há cepas que fermentadoras de lactose ou não produzem o Sulfeto de Hidrogênio é importante que o segundo ou o terceiro meio empregado no plaqueamento não seja baseado nessas duas características.

Confirmação

A confirmação tem como objetivo verificar se há o crescimento de colônias típicas de Salmonella ou não. Se houver o crescimento de colônias típicas de salmonella em meios sólidos é necessário realizar os testes bioquímicos e sorológicos. Se não houver o crescimento de colônias típicas as análises são encerradas na fase de isolamento em meios seletivo. Para a confirmação requer a purificação das colônias típicas em meios como o Ágar Nutriente, com o objetivo de obtenção de colônias puras de salmonella sem microbiota acompanhante. Geralmente para o teste bioqúimico utiliza-se o kit API 20E (sistema de identificação das Enterobacteriaceae e outros bacilos gram negativos não fastidiosos) e a confirmação sorológicas é realizada através da observação da aglutinação com a presença de antígenos poli "O" e poli "H" e se a Salmonella não estiver presente não há aglutinação.

Os testes bioquímicos têm incubação de 24 horas e a leitura é realizada através da observação de reações bioqúimicas contídos no Kit API 20E e a aglutinação é ocasionada ser houver a presença da salmonella e o resultado da reações é semelhante a leite coagulado.

As colônias típicas de salmonella em meios de plaqueamento como o HE são transparentes verde-azuladas, com ou sem centro negro, as cepas produtoras de de H2S podem produzir colônias com centro negro grande e brilhante ou inteiramente negras. As cepas que fermentam a lactose ou sacarose são de cor salmão e não transparentes.

A presença de Salmonella em meio XLD causa uma alteração no mesmo apresentando uma zona avermelhada diferente da cor característica do meio. As colônias típicas no meio XLD podem apresentar coloração rosa ou com centro negro envolvida com halo esbranquiçado ou transparente . Cepas que produzem H2S podem apresentar centro negro grande e brilhante, ou inteiramente negras e com halo, as negativas produzem colônias cor de rosa com centro mais escuro, mas não preto, e as cepas lactose positiva produzem colônias amarelas com ou centro negro.

Quadro de Interpretação de Resultados por testes de Aglutinação pelo metódo ISO 6579 (2007):

Resultados Testes Bioquímicos	Auto Aglutinação	Resultados sorológicos	Interpretação
Típicos	Não	Poli O e Poli H positivos	confirmação de Salmonella
Típicos	Não	todos negativos	pode ser Salmonella
Típicos	Sim	não se aplica	pode ser Salmonella
Atípicos	Não/sim	Poli O e Poli H positivos	pode ser Salmonella
Atípicos	Não/sim	todos negativos	não confirmado Salmonella

Quadro de Interpretação de Resultados para os testes Bioquímicos através do Kit API 20E:

Testes	Componentes Ativos	Reações/ Enzimas	Resultado Negativo	Resultado Positivo
ONPG	2-nitrofenil-D-galactopiranosida	galactosidase-galactopiranosidase	incolor	amarelo
ADH	L-arginina	arginina descarboxilase	amarelo	vermelho/alaranjado
LDC	L-lisina	lisina descarboxilase	amarelo	vermelho/alaranjado
ODC	L-ornitina	ornitina descarboxilase	amarelo	vermelho/alaranjado
CIT	citrato de sódio	utilização do citrato	verde pálido/amarelo	azul-esverdeado/ azul
H2S	tiossulfato de sódio	produção de H2S	incolor/acinzentado	depósito negro
URE	ureia	urease	amarelo	vermelho/alaranjado
TDA	L-triptofano	triptofano desamniase	amarelo	castanho-avermelhado
IND	L-triptofano	produção de indol	incolor/ verde pálido/amarelo	rosa
VP	piruvato de sódio	produção de aceloina	incolor/rosa pálido	rosa/vermelho
GEL	gelatina ( bovina)	Gelatinase	não-difuso	difusão do pigmento negro
GLU	D-glucose	fermentação/oxidação glucose	azul/azul - esverdeado	amarelo
MAN	D-manitol	fermentação/oxidação manitol	azul/azul - esverdeado	amarelo
INO	inositol	fermentação/oxidação inositol	azul/azul - esverdeado	amarelo
SOR	D-sorbitol	fermentação/oxidação sorbitol	azul/azul - esverdeado	amarelo
RHA	L-ramnose	fermentação/oxidação ramnose	azul/azul - esverdeado	amarelo
SAC	D-sorbitol	fermentação/oxidação sacarose	azul/azul - esverdeado	amarelo
MEL	D-melibiose	fermentação/oxidação melibiose	azul/azul - esverdeado	amarelo
AMY	amigdalina	fermentação/oxidação amigdalina	azul/azul - esverdeado	amarelo
ARA	L-arabinose	fermentação/oxidação arabinose	azul/azul - esverdeado	amarelo