Recombinação Cre-Lox: diferenças entre revisões
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Um dos usos mais conhecidos da recombinação Cre-Lox é a criação de animais nocaute condicionais<ref>{{Citar periódico|ultimo=Sauer|primeiro=Brian|titulo=Inducible Gene Targeting in Mice Using the Cre/loxSystem|url=https://doi.org/10.1006/meth.1998.0593|jornal=Methods|volume=14|numero=4|paginas=381–392|doi=10.1006/meth.1998.0593}}</ref>, onde a modificação desejada ocorrerá apenas após um estímulo desejado. Isso permite a alteração de sequências de DNA em tecidos específicos ou em momentos específicos do desenvolvimento, driblando possíveis efeitos letais se a alteração ocorresse globalmente. |
Um dos usos mais conhecidos da recombinação Cre-Lox é a criação de animais nocaute condicionais<ref>{{Citar periódico|ultimo=Sauer|primeiro=Brian|titulo=Inducible Gene Targeting in Mice Using the Cre/loxSystem|url=https://doi.org/10.1006/meth.1998.0593|jornal=Methods|volume=14|numero=4|paginas=381–392|doi=10.1006/meth.1998.0593}}</ref>, onde a modificação desejada ocorrerá apenas após um estímulo desejado. Isso permite a alteração de sequências de DNA em tecidos específicos ou em momentos específicos do desenvolvimento, driblando possíveis efeitos letais se a alteração ocorresse globalmente. |
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Este tipo especial de recombinação sítio-específica foi desenvolvida primeiramente pelo Dr. Brian Sauer, usada ativando expressão gênica em células de mamífero<ref>{{Citar periódico|ultimo=Sauer|primeiro=B.|data=1987-06-01|titulo=Functional expression of the cre-lox site-specific recombination system in the yeast Saccharomyces cerevisiae.|url=http://mcb.asm.org/content/7/6/2087|jornal=Molecular and Cellular Biology|lingua=en|volume=7|numero=6|paginas=2087–2096|doi=10.1128/mcb.7.6.2087|issn=0270-7306|pmid=3037344}}</ref><ref>{{Citar periódico|ultimo=Sauer|primeiro=B.|ultimo2=Henderson|primeiro2=N.|data=1988-07-01|titulo=Site-specific DNA recombination in mammalian cells by the Cre recombinase of bacteriophage P1|url=http://www.pnas.org/cgi/doi/10.1073/pnas.85.14.5166|jornal=Proceedings of the National Academy of Sciences|volume=85|numero=14|paginas=5166–5170|doi=10.1073/pnas.85.14.5166}}</ref>. Sequêncialmente, pesquisadores no laboratório do Dr. Jamey Marth demonstraram que a recombinação Cre-Lox poderia ser usada para deletar sequências de DNA flanqueadas por sítios loxP em eficiências altas em células T de animais transgênicos, com os autores propontdo que essa abordagem poderia ser usada para definir a função gênica endógena em tipos celulares específicos, marcar progenitores em estudos de determinação de destino celular, induzir rearranjos cromossômicos específicos para modelagem biológica e de doenças e determinar os papéis de lesões genéticas precoces na manutenção de doenças<ref>{{Citar periódico|ultimo=Sauer|primeiro=B.|ultimo2=Henderson|primeiro2=N.|data=1988-07-01|titulo=Site-specific DNA recombination in mammalian cells by the Cre recombinase of bacteriophage P1|url=http://www.pnas.org/cgi/doi/10.1073/pnas.85.14.5166|jornal=Proceedings of the National Academy of Sciences|volume=85|numero=14|paginas=5166–5170|doi=10.1073/pnas.85.14.5166}}</ref>. |
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Logo depois, pesquisadores no laboratório do Prof. Klaus Rajewsky relataram a produção de [[Célula-tronco pluripotente induzida|células iPS]] carregando um gene de DNA polimerase flanqueado por loxP<ref>{{Citar periódico|ultimo=Gu|primeiro=Hua|ultimo2=Zou|primeiro2=Yong-Rui|ultimo3=Rajewsky|primeiro3=Klaus|titulo=Independent control of immunoglobulin switch recombination at individual switch regions evidenced through Cre-loxP-mediated gene targeting|url=http://linkinghub.elsevier.com/retrieve/pii/0092867493906446|jornal=Cell|volume=73|numero=6|paginas=1155–1164|doi=10.1016/0092-8674(93)90644-6}}</ref>. Combinando esses avanços em colaboração, os laboratórios dos Drs. Marth e rajewsky relataram em 1994 que a recombinação Cre-Lox poderia ser usada para modificação condicional de genes em células T em desenvolvimento em camundongos<ref>{{Citar periódico|ultimo=Gu|primeiro=H.|ultimo2=Marth|primeiro2=J. D.|ultimo3=Orban|primeiro3=P. C.|ultimo4=Mossmann|primeiro4=H.|ultimo5=Rajewsky|primeiro5=K.|data=1994-07-01|titulo=Deletion of a DNA polymerase beta gene segment in T cells using cell type-specific gene targeting|url=http://science.sciencemag.org/content/265/5168/103|jornal=Science|lingua=en|volume=265|numero=5168|paginas=103–106|doi=10.1126/science.8016642|issn=0036-8075|pmid=8016642}}</ref>. Eles observaram que aproximadamente 50% do gene da DNA polimerase beta havia sido deletado. Ainda estava incerto se apenas um [[alelo]] havia sido deletado em cada célula T ou se metade das células T haviam delatedo ambos os alelos.. Pesquisadores relataram então recombinação Cre-Lox condicional mais eficiente no laboratório Marth em 1995<ref>{{Citar periódico|ultimo=Hennet|primeiro=T.|ultimo2=Hagen|primeiro2=F. K.|ultimo3=Tabak|primeiro3=L. A.|ultimo4=Marth|primeiro4=J. D.|data=1995-12-19|titulo=T-cell-specific deletion of a polypeptide N-acetylgalactosaminyl-transferase gene by site-directed recombination|url=http://www.pnas.org/cgi/doi/10.1073/pnas.92.26.12070|jornal=Proceedings of the National Academy of Sciences|volume=92|numero=26|paginas=12070–12074|doi=10.1073/pnas.92.26.12070}}</ref>. Deleção incompleta de genes em células com dois alelos flanqueados por sítios loxP não é incomum. |
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Independentemente, Joe Z. Tsien foi pioneiro no uso do sistema Cre-Lox para manipulação de modo específico a nível de célula e região no cérebro adulto, onde centenas de tipos neuronais podem existir e onde quase todos os neurônios no adulto são pós-mitóticos<ref>{{Citar periódico|ultimo=Tsien|primeiro=Joe Z.|data=2016|titulo=Cre-Lox Neurogenetics: 20 Years of Versatile Applications in Brain Research and Counting…|url=http://journal.frontiersin.org/Article/10.3389/fgene.2016.00019/abstract|jornal=Frontiers in Genetics|lingua=English|volume=7|doi=10.3389/fgene.2016.00019|issn=1664-8021}}</ref>. Tsien e colaboradores mostraram que recombinação mediada por Cre pode ocorrer nos neurônios piramidais pós-mitóticos no cérebro de camundongos adultos<ref>{{Citar periódico|ultimo=Tsien|primeiro=Joe Z|ultimo2=Chen|primeiro2=Dong Feng|ultimo3=Gerber|primeiro3=David|ultimo4=Tom|primeiro4=Cindy|ultimo5=Mercer|primeiro5=Eric H|ultimo6=Anderson|primeiro6=David J|ultimo7=Mayford|primeiro7=Mark|ultimo8=Kandel|primeiro8=Eric R|ultimo9=Tonegawa|primeiro9=Susumu|titulo=Subregion- and Cell Type–Restricted Gene Knockout in Mouse Brain|url=http://linkinghub.elsevier.com/retrieve/pii/S0092867400818267|jornal=Cell|volume=87|numero=7|paginas=1317–1326|doi=10.1016/s0092-8674(00)81826-7}}</ref>. |
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Esses avanços levaram a um uso generalizado de mutagênese condicional em pesquisa biomédica, afetando diversas disciplinas, se tornando uma poderosa ferramenta para determinar função gênica em tipos celulares específicos e em momentos específicos do desenvolvimento. |
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Revisão das 16h51min de 16 de abril de 2018
Recombinação Cre-Lox é uma tecnologia de recombinação sítio-específica, cujo nome vem do uso da enzima Cre recombinase e sítios loxP[1]. Derivada do mecanismo natural de recombinação do bacteriófago P1[2], a recombinação Cre-Lox é utilizada para diversos usos científicos e tecnológicos, notavelmente inserções, deleções, inversões e translocações sítio-específicas em sequências de DNA. Diz-se que uma sequência é “floxed” quando está flanqueada por sítios Lox.
Um dos usos mais conhecidos da recombinação Cre-Lox é a criação de animais nocaute condicionais[3], onde a modificação desejada ocorrerá apenas após um estímulo desejado. Isso permite a alteração de sequências de DNA em tecidos específicos ou em momentos específicos do desenvolvimento, driblando possíveis efeitos letais se a alteração ocorresse globalmente.
Histórico
Este tipo especial de recombinação sítio-específica foi desenvolvida primeiramente pelo Dr. Brian Sauer, usada ativando expressão gênica em células de mamífero[4][5]. Sequêncialmente, pesquisadores no laboratório do Dr. Jamey Marth demonstraram que a recombinação Cre-Lox poderia ser usada para deletar sequências de DNA flanqueadas por sítios loxP em eficiências altas em células T de animais transgênicos, com os autores propontdo que essa abordagem poderia ser usada para definir a função gênica endógena em tipos celulares específicos, marcar progenitores em estudos de determinação de destino celular, induzir rearranjos cromossômicos específicos para modelagem biológica e de doenças e determinar os papéis de lesões genéticas precoces na manutenção de doenças[6].
Logo depois, pesquisadores no laboratório do Prof. Klaus Rajewsky relataram a produção de células iPS carregando um gene de DNA polimerase flanqueado por loxP[7]. Combinando esses avanços em colaboração, os laboratórios dos Drs. Marth e rajewsky relataram em 1994 que a recombinação Cre-Lox poderia ser usada para modificação condicional de genes em células T em desenvolvimento em camundongos[8]. Eles observaram que aproximadamente 50% do gene da DNA polimerase beta havia sido deletado. Ainda estava incerto se apenas um alelo havia sido deletado em cada célula T ou se metade das células T haviam delatedo ambos os alelos.. Pesquisadores relataram então recombinação Cre-Lox condicional mais eficiente no laboratório Marth em 1995[9]. Deleção incompleta de genes em células com dois alelos flanqueados por sítios loxP não é incomum.
Independentemente, Joe Z. Tsien foi pioneiro no uso do sistema Cre-Lox para manipulação de modo específico a nível de célula e região no cérebro adulto, onde centenas de tipos neuronais podem existir e onde quase todos os neurônios no adulto são pós-mitóticos[10]. Tsien e colaboradores mostraram que recombinação mediada por Cre pode ocorrer nos neurônios piramidais pós-mitóticos no cérebro de camundongos adultos[11].
Esses avanços levaram a um uso generalizado de mutagênese condicional em pesquisa biomédica, afetando diversas disciplinas, se tornando uma poderosa ferramenta para determinar função gênica em tipos celulares específicos e em momentos específicos do desenvolvimento.
Componentes
Cre recombinase
A proteína Cre (assim nomeada pela abreviação de "causes recombination" ou "cyclization recombinase")[12][13] tem 343 aminoácidos e consiste de 4 subunidades e dois domínios: um domínio C-terminal maior e um N-terminal menor. O domínio C-terminal tem estrutura similar a domínios na família de integrases isolada de bacteriófago λ, e também é o sítio catalítico dessa enzima[14].
Sítios LoxP
Os sítios loxP são sequências de 34 pb, consistindo de duas sequências simétricas de 13 pb flanqueando uma sequência simétrica de 8 pb, portando sendo dotados de direcionalidade, o que define como a enzima irá modificar a sequência. A recombinação pode ocorrer tanto in cis como in trans, o que abre também possibilidades de troca de sequências ou integração com plasmídeos.
Para alguns usos é necessário fazer múltiplas recombinações no mesmo organismo em sítios diferentes. Para isso são usados sítios loxP alternativos, que possuem sua sequência central modificada[15]. A Cre recombinase irá interagir ao mesmo tempo apenas com sítios com sequências assimétricas iguais, criando a possibilidade de um sistema com recombinações múltiplas que não interferem umas nas outras (ortogonais).
Nome | Região simétrica de 13pb | Região assimétrica de 8pb | Região simétrica de 13pb |
---|---|---|---|
Selvagem | ATAACTTCGTATA | ATGTATGC | TATACGAAGTTAT |
lox 511 | ATAACTTCGTATA | ATGTATaC | TATACGAAGTTAT |
lox 5171 | ATAACTTCGTATA | ATGTgTaC | TATACGAAGTTAT |
lox 2272 | ATAACTTCGTATA | AaGTATcC | TATACGAAGTTAT |
M2 | ATAACTTCGTATA | AgaaAcca | TATACGAAGTTAT |
M3 | ATAACTTCGTATA | taaTACCA | TATACGAAGTTAT |
M7 | ATAACTTCGTATA | AgaTAGAA | TATACGAAGTTAT |
M11 | ATAACTTCGTATA | AGATAGAA | TATACGAAGTTAT |
lox 71 | TACCGTTCGTATA | NNNTANNN | TATACGAAGTTAT |
lox 66 | ATAACTTCGTATA | NNNTANNN | TATACGAACGGTA |
Mecanismo
A Cre recombinase atua nos sítios loxP ligando-se nas regiões simétricas nas bordas dos sítios, formando um dímero. O corte da fita de DNA será feito de acordo com sua direcionalidade, definida pela sequência assimétrica no meio desse sítio[16]. Esse dímero irá então se associar a outro dímero de Cre recombinase, formando um tetrâmero, promovendo o corte de uma das fitas de DNA e, junto à ação de DNA ligase, a criação de um intermediário de junção de Holliday[17]. As fitas simples geradas podem então ser alongadas por uma DNA polimerase para terminar o rearranjo das sequências, gerando deleções, inversões e translocações.
Animais Nocaute
Muitos fatores durante o desenvolvimento podem exibir funções múltiplas em locais diferentes do organismo, ou em momentos diferentes da ontogenia, dependendo do contexto em que se encontra. A sinalização de Notch, por exemplo, é usada tanto durante a formação neural quanto da somitogênese[18][19]. É possível portanto que a criação de um animal nocaute para alguma função específica seja inviável, se o que exerce essa função tem papel vital em outro momento da ontogenia ou em outro órgão ou tecido corporal. Por isso se dá a importância de uma tecnologia capaz de fazer deleções tecido-específicas em momentos específicos, dependendo de um input externo.
Normalmente são feitos animais nocaute pelo cruzamento de linhagens de animais modificadas, uma com a alteração em questão, a sequência floxed, e outra com expressão de Cre recombinase. É possível fazer deleção condicional através do uso de uma recombinase expressa por um promotor condicional ou com ação tecido-específica[20]. Deste modo apenas aquelas células que conseguirem ativar o promotor irão ter a sequência floxed modificada.
Outra forma de controle espacial da deleção é a injeção de Cre recombinase viral manualmente através de vetores de adenovírus ou lentivírus, tornando a expressão de Cre tão específica quanto a capacidade de isolar áreas a serem infectadas com vetores virais[21].
O controle temporal de expressão de Cre é mais utilizado com dois sistemas: indução por tetraciclina ou por tamoxifeno. O controle por teraciclina advém do mecanismo bacteriano de resistência a tetraciclina, composto pela proteína tetR e a sequência de DNA operador tetO. O sistema pode ser arranjado para levar à expressão de Cre na ausência ou presença de tetraciclina ou doxiciclina (Tet-Off e Tet-On, respectivamente). O sistema indutível por tamoxifeno funciona à base da fusão da Cre recombinase a um domínio do receptor de estrogênio humano, que na ausência de tamoxifeno impede a entrada da enzima no núcleo da célula, impedindo recombinação. As alterações pela recombinase podem então ser controladas temporalmente de acordo com a administração de tamoxifeno. É importante ressaltar que estes sistemas podem apresentar expressão basal de Cre dependendo do contexto celular e levar a deleções não intencionais, podendo levar a problemas de viabilidade embrionária.
Referências
- ↑ Van Duyne, Gregory D. (5 de fevereiro de 2015). «Cre Recombinase». Microbiology Spectrum (em inglês). 3 (1). ISSN 2165-0497. doi:10.1128/microbiolspec.mdna3-0014-2014
- ↑ Abremski, Kenneth; Hoess, Ronald. «Phage P1 Cre-loxP site-specific recombination». Journal of Molecular Biology. 184 (2): 211–220. doi:10.1016/0022-2836(85)90374-2
- ↑ Sauer, Brian. «Inducible Gene Targeting in Mice Using the Cre/loxSystem». Methods. 14 (4): 381–392. doi:10.1006/meth.1998.0593
- ↑ Sauer, B. (1 de junho de 1987). «Functional expression of the cre-lox site-specific recombination system in the yeast Saccharomyces cerevisiae.». Molecular and Cellular Biology (em inglês). 7 (6): 2087–2096. ISSN 0270-7306. PMID 3037344. doi:10.1128/mcb.7.6.2087
- ↑ Sauer, B.; Henderson, N. (1 de julho de 1988). «Site-specific DNA recombination in mammalian cells by the Cre recombinase of bacteriophage P1». Proceedings of the National Academy of Sciences. 85 (14): 5166–5170. doi:10.1073/pnas.85.14.5166
- ↑ Sauer, B.; Henderson, N. (1 de julho de 1988). «Site-specific DNA recombination in mammalian cells by the Cre recombinase of bacteriophage P1». Proceedings of the National Academy of Sciences. 85 (14): 5166–5170. doi:10.1073/pnas.85.14.5166
- ↑ Gu, Hua; Zou, Yong-Rui; Rajewsky, Klaus. «Independent control of immunoglobulin switch recombination at individual switch regions evidenced through Cre-loxP-mediated gene targeting». Cell. 73 (6): 1155–1164. doi:10.1016/0092-8674(93)90644-6
- ↑ Gu, H.; Marth, J. D.; Orban, P. C.; Mossmann, H.; Rajewsky, K. (1 de julho de 1994). «Deletion of a DNA polymerase beta gene segment in T cells using cell type-specific gene targeting». Science (em inglês). 265 (5168): 103–106. ISSN 0036-8075. PMID 8016642. doi:10.1126/science.8016642
- ↑ Hennet, T.; Hagen, F. K.; Tabak, L. A.; Marth, J. D. (19 de dezembro de 1995). «T-cell-specific deletion of a polypeptide N-acetylgalactosaminyl-transferase gene by site-directed recombination». Proceedings of the National Academy of Sciences. 92 (26): 12070–12074. doi:10.1073/pnas.92.26.12070
- ↑ Tsien, Joe Z. (2016). «Cre-Lox Neurogenetics: 20 Years of Versatile Applications in Brain Research and Counting…». Frontiers in Genetics (em English). 7. ISSN 1664-8021. doi:10.3389/fgene.2016.00019
- ↑ Tsien, Joe Z; Chen, Dong Feng; Gerber, David; Tom, Cindy; Mercer, Eric H; Anderson, David J; Mayford, Mark; Kandel, Eric R; Tonegawa, Susumu. «Subregion- and Cell Type–Restricted Gene Knockout in Mouse Brain». Cell. 87 (7): 1317–1326. doi:10.1016/s0092-8674(00)81826-7
- ↑ «cyclization recombinase [Escherichia coli] - Protein - NCBI». www.ncbi.nlm.nih.gov. Consultado em 16 de abril de 2018
- ↑ Sternberg, Nat; Hamilton, Daniel. «Bacteriophage P1 site-specific recombination». Journal of Molecular Biology. 150 (4): 467–486. doi:10.1016/0022-2836(81)90375-2
- ↑ «cre - Recombinase cre - Escherichia phage P1 - cre gene & protein». www.uniprot.org (em inglês). Consultado em 16 de abril de 2018
- ↑ Missirlis, Perseus I.; Smailus, Duane E.; Holt, Robert A. (4 de abril de 2006). «A high-throughput screen identifying sequence and promiscuity characteristics of the loxP spacer region in Cre-mediated recombination». BMC Genomics. 7. 73 páginas. ISSN 1471-2164. doi:10.1186/1471-2164-7-73
- ↑ Lee, Linda; Sadowski, Paul D. «Sequence of the loxP Site Determines the Order of Strand Exchange by the Cre Recombinase». Journal of Molecular Biology. 326 (2): 397–412. doi:10.1016/s0022-2836(02)01429-8
- ↑ Gopaul, Deshmukh N.; Guo, Feng; Duyne, Gregory D. Van (15 de julho de 1998). «Structure of the Holliday junction intermediate in Cre–loxP site‐specific recombination». The EMBO Journal (em inglês). 17 (14): 4175–4187. ISSN 0261-4189. PMID 9670032. doi:10.1093/emboj/17.14.4175
- ↑ Imayoshi, Itaru; Kageyama, Ryoichiro (1 de agosto de 2011). «The Role of Notch Signaling in Adult Neurogenesis». Molecular Neurobiology (em inglês). 44 (1): 7–12. ISSN 0893-7648. doi:10.1007/s12035-011-8186-0
- ↑ Weinmaster, 1Gerry; Kintner, 2Chris (1 de novembro de 2003). «Modulation of Notch Signaling During Somitogenesis». Annual Review of Cell and Developmental Biology. 19 (1): 367–395. ISSN 1081-0706. doi:10.1146/annurev.cellbio.19.111301.115434
- ↑ Utomo, Ahmad R.H.; Nikitin, Alexander Yu.; Lee, Wen-Hwa (novembro de 1999). «Temporal, spatial and cell type–specific control of Cre-mediated DNA recombination in transgenic mice». Nature Biotechnology (em inglês). 17 (11): 1091–1096. ISSN 1546-1696. doi:10.1038/15073
- ↑ Walrath, Jessica C.; Hawes, Jessica J.; Dyke, Terry Van; Reilly, Karlyne M. «Genetically Engineered Mouse Models in Cancer Research»: 113–164. doi:10.1016/s0065-230x(10)06004-5