Mycobacterium

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Mycobacterium leprae

Mycobacterium leprae
Classificação científica
Reino: Bacteria
Filo: Actinobacteria
Classe: Actinomycetes
Ordem: Actinomycetales
Família: Mycobacteriaceae
Género: Mycobacterium
Espécies
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Mycobacterium ou micobactéria é um gênero de actinobactérias bacilares, aeróbicas obrigatórias, imóveis e altamente patogênicas, que causam diversas doenças, sendo as mais famosas Hanseníase (lepra) e tuberculose. Possuem a forma de bacilos retos ou levemente curvado, sem a presença de flagelos ou de cápsula, além de não ter formação do endosporo. Apesar das micobactérias não possuírem membrana externa e, por isso, se assemelharem às gram-positivas, seu alto teor lipídico confere diferenças estruturais importantes na parede. A presença de ácidos graxos no envelope confere uma álcool-ácido resistência (AAR) - retendo fucsina básica pela parede mesmo na presença de álcool e ácido durante a coloração de Gram. Microorganismo intracelulares, que infectam e proliferam-se dentro de macrófagos.

As manifestações clínicas de infecções micobacterianas decorrem da resposta imunológica do hospedeiro à infecção e aos antígeos que portam. Possuem inúmeras resistências a antibióticos típicos e exigem tratamentos de muitas semanas, meses ou anos. Normalmente administrado mais de um antibiótico, já que algumas cepas já apresentam resistência antimicrobiana considerável. [1]

Parede celular[editar | editar código-fonte]

Diferente de outras bactérias gram-positivas ou gram-negativas, as micobactérias possuem peptideoglicano com ácido N-glicolilmurâmico em vez de ácido N-acetilmurâmico. A parede celular é constituída de cerca de 60% de ácidos micólicos (ácidos graxos de cadeia longa incomum), covalentemente ligados ao polissacarídeo que compõe a parede. A presença de alguns lipídeos livres com epítopos passiveis de reconhecimento pelo hospedeiro não estão covalentemente associados ao esqueleto basal. Possuem proteínas de membrana formadoras de canais catiônicos (porinas), que controlam a difusão de moléculas hidrofílicas. A Mycobacterium tuberculosis possui uma das paredes mais permeáveis a agentes antimicrobiano hidrofílicos. [1] A singularidade da parede permite que o microorganismo sobreviva dentro de macrófagos - que normalmente aniquilam patógenos fagocitados - facilitando a agregação bacteriana e tornando-as mais resistentes a muitos desinfetantes químicos, o que dificulta sua prevenção.

Coloração[editar | editar código-fonte]

O alto teor lipídico das micobactérias confere à esta a álcool-ácido resistência, que impede a coloração das bactérias pela técnica de Gram, normalmente utilizada. Entretanto, se a porção lipídica for removida com etanol alcalino, a bactéria perde a característica de álcool-acido resistência, permitindo que sua coloração assemelhe-se às gram-positivas. A técnica de Ziehl-Neelsen é eficaz com essas bactérias, utilizando uma mistura de fucsina com fenol, envolvendo aquecimento na própria lâmina até que gere vapor. O diferencial dessa mistura é o fenol, que aumenta a absorção da fucsina nos lipídios (ocorrerá ligação do NH2+ da fucsina com o COO- do ácido micólico). Após essa aplicação, o esfregaço é lavado e tratado com álcool-ácido, sendo lavado mais uma vez para ser corado com azul de metileno, realizando o papel de contraste. O resultado é a coloração em vermelho aos acidorresistentes, e o restante em azul. [2]

Mycobacterium tuberculosis em vermelho (coloração)

Meio de cultura[editar | editar código-fonte]

Possui um meio desenvolvido especialmente para seu plaqueamento, o meio Löwenstein–Jensen (LJ), que é utilizado principalmente para o cultivo da Mycobacterium tuberculosis. Diferenças entre as espécies englobam mudanças na temperatura ótima de cultivo e tempo médio de crescimento.

COMPOSIÇÃO (g/L)

L-Asparagina: 3.60 

Fosfato monopotássico: 2.40 

Sulfato de magnésio: 0.24 

Citrato de magnésio: 0.60 

Amido de batata, solúvel: 30.00 

Verde malaquita: 0.400

Meio de cultura Löwenstein–Jensen com bactérias tuberculosas.

Essa é a composição basal, comprada em forma de um pó azul esverdeado. A ele, devem ser acrescentados 12mL de glicerol e 1000mL de emulsão de ovo. Nesse momento o meio adquire uma cor verde azulada pálida, e um pouco opaca.

A l-asparagina e o amido de batata são fontes de nitrogênio e vitaminas. Sulfato de magnésio e fosfato monopotássico agem como fatores de crescimento, e o glicerol e a emulsão de ovo fornecem ácidos graxos e aminoácidos e são fonte de carbono. O verde malaquita é composto que impede a contaminação a cultura por fungos e outros microrganismos, garantindo uma cultura pura.

Esse meio é muito importante para o diagnóstico precoce da tuberculose, mas seu grande problema se da pelo fato de que as colônias demoram para serem formadas devido ao crescimento lento da bactéria (colônias visíveis de 2 a 20 dias em temperatura ótima). Isso dificulta muito a rapidez de diagnóstico, e por isso técnicas alternativas são bastante pesquisadas e exploradas. Por não serem nem gram-positivas nem gram-negativas, podem ser cultivadas com antibióticos para esses dois tipos de bactérias, o que minimiza e evita contaminações.

A Mycobacterium leprae não é cultivada nesse meio ou em qualquer outro, sendo utilizado modelos experimentais para análise da hanseníase. O uso de tatu selvagem em laboratórios como modelo experimental ainda é o mais adequado. [3][4]

Metabolismo[editar | editar código-fonte]

Devido à baixa velocidade de crescimento e a dificuldade de cultura dessas bactérias, o metabolismo dessas bactérias não é definido para todas as espécies. Suas necessidades nutricionais englobam:

  • fonte de carbono orgânica
  • fonte de nitrogênio (NH4+)
  • elementos inorgânicos usuais (Mg2+ , SO4 2 ~, K + , PO4 3 ", Fe3 +, etc.).

Dentre as principais bactérias patogênicas, a Mycobacterium tuberculosis usa como principal fonte de carbono o colesterol e esteroides derivados de sua degradação como metabólitos adicionais. Uma via de regulação da ativação dos genes que participam do catabolismo do colesterol inicia-se com sua oxidação, até eventualmente alimentar o ciclo de Krebs (TCA Cicle) ou ser usado para o anabolismo da bactéria.[5]

A Mycobacterium leprae usa principalmente os lipídios como fonte de carbono. Eles também são oxidados e eventualmente servem de substrato para o ciclo de Krebs, que enfim fornece ATP para a bactéria.Como a M. leprae só cresce em hospedeiros específicos e não cresce em meios de culturas padrão para micobactérias, elas não produzem todos os metabólitos necessários ao seu crescimento. Entretanto, como seu crescimento ocorre em hospedeiros específicos, é de difícil determinação quais nutrientes ela precisa utilizar do meio em que se encontra, sendo os mecanismos gerais de seu metabolismo ainda nebulosos. [6]

Micobactérias patogênicas[editar | editar código-fonte]

Patógenos obrigatórios[editar | editar código-fonte]

M. tuberculosis: Tuberculose humana

M. bovis: Tuberculose humana/bovina

M. leprae: Hanseníase

Patógenos cutâneos[editar | editar código-fonte]

M. marinum: Infecções cutâneas profundas

M. ulcerans: Lesões cutâneas ulceradas

Patógenos oportunistas[editar | editar código-fonte]

M. kansasii: Infecções pulmonares

M. avium intracellulare: Infecção disseminada em pacientes com aids

M. africanum: Tuberculose humana

[7]

Biossegurança[editar | editar código-fonte]

Algumas bactérias do gênero Mycobacterium são causadoras de doenças extremamente perigosas, como a hanseníase e a tuberculose. A manipulação desses patógenos requer laboratórios equipados de acordo com os Níveis de Biossegurança (NB), requisitos padronizados para a manipulação de microrganismos patógenos.

Esses níveis são definidos de acordo com a classe de risco desses microrganismos (determinada pelo risco potencial oferecido ao individuo, à comunidade e ao meio ambiente) e ao tipo de manipulação que será realizada. [8]

CLASSE DE RISCO 1: todas as Mycobacterium não incluídas em outras classes de risco.

CLASSE DE RISCO 2: M. leprae, M. asiaticum, M. avium, M. bovis BCG vacinal, M. intracellulare, M. chelonae, M. fortuitum, M. kansasii, M. malmoense, M.marinum, M. paratuberculosis, M. scrofulaceum, M. simiae, M. szulgai,M. xenopi

CLASSE DE RISCO 3:M. bovis (exceto a cepa BCG) e M. tuberculosis [9]

O número da classe de risco não corresponde ao NB necessariamente. Existem micobactérias,como a M.smegmatis, que são da classe de risco 1 e correspondem ao NB 1, e a M.leprae, que é da classe 2 e corresponde ao NB 2. Por outro lado, existem casos como a M.tuberculosis, que faz parte da classe de risco 3, mas pode corresponder ao NB 2 ou 3, dependendo do tipo de manuseio a ser realizado. [10]

Antibióticos[editar | editar código-fonte]

Devido a característica de álcool-ácido resistência, as micobactérias possuem antimicrobianos específicos para o tratamento de enfermidades causadas pelas bactérias patogênicas. Os casos de resistência aos fármacos pela micobactéria ocorre devido às mutações espontâneas que ocorrem nas replicações dessas bactérias - não envolvendo plasmídeos e transposons (elementos móveis) como ocorre na maioria das bactérias resistentes a antibióticos.

rifampicina é um importante antibiótico no tratamento da tuberculose, hanseníase e outras doenças causadas por micobactérias. É um composto semi-sintético produzido a partir da rifampicina B, que é obtida comercialmente pela fermentação a partir do Streptomyces mediterranei. Pertencente à família dos antibióticos ansamicinas, é um antibiótico bactericida que se liga a subunidade beta da RNA polimerase e inibe a transcrição gênica da micobactéria por bloqueio da RNA-polimeras dependente de DNA. Isso impede a síntese de RNA mensageiro (mRNA), produzindo morte celular. O mecanismo de resistência a esse fármaco resulta de mutações na região central do gen rpoB, que codifica a subunidade β da RNA-polimerase . As mutações modificam a estrutura desta enzima, fazendo com que a RMP perca a capacidade de bloqueá-la, liberando a síntese de mRNA. 

Observação importante: A utilização da rifampicina em pacientes portadores de HIV pode promover interações farmacológicas do sistema hepático e intestinal com a maioria dos anti-retrovirais utilizados, o que pode provocar uma redução significativa dos níveis plasmáticos dos mesmos. Esse fato pode levar à diminuição da eficácia e ao aumento do risco de desenvolvimento de resistência do vírus HIV ao esquema de medicamentos anti-retrovirais. Assim, é necessário a utilização de processos alternativos, sem a presença da rifampicina.

isoniazida, medicamento mais conhecido no tratamento da tuberculose devido a sua alta especificidade e também aquele com maior frequência de ocorrência de resistência, foi descoberto em 1952. O gene katG codifica a enzima catalase-peroxidase, importante no metabolismo do bacilo. Esta enzima ativa a isoniazida, produzindo radicais reativos de oxigênio e radicais orgânicos que inibem a formação de ácidos micólicos da parede bacilar e produzem dano no DNA.O gene inhA codifica a enzima carreadora de enoil (acil redutase) NADH dependente, que é importante na síntese de ácidos micólicos. Um dos produtos da isoniazida ativada  (o radical acil isonicotínico) liga-se à NADH e impede a atividade da enzima, resultando na morte da bactéria por interferência na síntese do ácidos micólicos. As micobactérias que apresentam resistência à Isoniazida geralmente se livram dessa enzima que ativa o medicamento ou apresentam mutações, como no gene katG  há diminuição da ação da catalase. A mutação estrutural do gene inhA faz com que a enzima modificada perca afinidade pela NADH. Ambas mutações resultam em resistência É bacteriostático e é utilizado ate hoje, embora algumas linhagens já apresentem resistência ao medicamento.

A Pirazinamida é um antibiótico muito utilizado no tratamento da Tuberculose. Não se sabe o exato mecanismo de ação pelo qual a pirazinamida inibe o crescimento da Mycobacterium tuberculosis (Mtb), porém sabe-se que ela tem atividade altamente específica contra essa micobactéria, não exercendo qualquer efeito sobre as outras. É provável que a quebra da molécula da pirazinamida através de sua enzima pirazinamidase-nicotinamidase nessas micobactérias produz ácido pirazinoico, a forma ativa da droga, em pH ácido. A atividade defeituosa da pirazinamidase, devido a mutações no pncA, é a principal causa de resistência a pirazinamida.

Etambutol é um tuberculostático sintético e micobacteriostático que não possui efeito sobre outras bactérias. O exato mecanismo não está totalmente conhecido, mas parece inibir a síntese de metabólitos, levando ao dano ao metabolismo celular, parada da multiplicação e morte celular. É ativo apenas quando a célula estiver em divisão.A resistência desenvolve-se in vivo, quando administrada na ausência de outra droga eficaz.

A Dapsona é um medicamento utilizado para diversos problemas que afetam a pele. Muito usado no tratamento da Hanseníase, ele age inibindo a síntese de ácido fólico, pela competição com o ácido para-amino-benzóico (PABA) na bactéria, devido a sua similaridade estrutural. Com isso há inibição na formação de DNA e RNA, impedindo a replicação e transcrição do mesmo, afinal o PABA é essencial na síntese de ácido fólico e consequentemente para a síntese de purinas, envolvidas diretamente na formação de DNA e RNA. A resistência à dapsona é associada às mutações nos códons 53 e 55 no gene folp1, gene relacionado à biossíntese de folato.

Clofazimina: Ela tem ação bacteriostática com relação ao bacilo de Hansen, ou seja  inibe o crescimento micobacteriano, e, também segundo alguns, uma ação antinflamatória. Ainda não foi demonstrada resistência do Mycobacterium leprae à clofazimina e pouco se sabe sobre seu mecanismo de ação exato.

A associação da dapsona, rifampicina e clofazimina é eficaz no tratamento da hanseníase multibacilar, entretanto a dapsona é responsável por inúmeros efeitos colaterais, tais como anemia hemolítica, metahemoglobinemia, erupções cutâneas, neuropatias, agranulocitose, entre outras. Por isso tratamentos alternativos, como a substituição da dapsona pela ofloxacina, ou a utilização do sistema ROM (rifampicina, ofloxacina e minociclina) estão sendo aplicados atualmente.

A ofloxacina, uma droga do grupo das fluoroquinolonas, que possui grande espectro de ação, inibe a replicação do DNA devido à ligação com a subunidade A da DNA girase no gene gyrA. Mutações associadas com o gene gyrA são comumente relatadas em micobactérias. As mutações identificadas até o momento no gene gyrA encontram-se no códon 89 e no códon 91. Também substituições de aminoácidos nos códons 91 e 94 são associadas com resistência às quinolonas.

As fluoroquilonas demonstraram poderosa atividade tuberculocida. Seu uso no tratamento da doença aumentou pelos recentes surtos de tuberculose resistente à diversas drogas. Entretanto, a utilização frequente das fluoroquinolonas no tratamento de diversas outras doenças infecciosas está gerando bactérias resistentes à essas drogas. Esse antibiótico pode desencadear uma vasta onda de efeitos colaterais debilitantes e portanto não devem ser usadas como primeira linha de tratamento.

O tratamento das doenças é mais eficaz quando administrado combinações de antibióticos, diminuindo a quase 0% as chances da bactéria possuir resistência aos dois medicamentos utilizados.

Micobacteriófagos[editar | editar código-fonte]

Micobacteriófagos são um tipo de vírus bacteriófago que têm micobactérias como hospedeiras. Originalmente isolados de Mycobacterium smegmatis [11], hoje são conhecidos mais de 4,200 micobacteriófagos, sendo mais de 500 completamente sequenciados.[12] Todos os micobacteriófagos conhecidos apresentam DNA de fita dupla e são classificados nas famílias Siphoviridae e Myoviridae [13]. Devido a uma especificidade de hospedeiro relativamente alta, micobacteriófagos podem ser usados para identificar espécies e linhagens de micobactérias. [14] Nos anos 1980, micobacteriófagos foram descobertos como ferramentas para a manipulação genética de micobactérias [15][16], apresentando possibilidade para, no futuro, serem usados para identificar resistência [17] ou tratar infecções [18].

Biotecnologia[editar | editar código-fonte]

O uso de micobactérias para a biotecnologia se volta principalmente para a cura de suas principais doenças, a tuberculose e a hanseníase [19]. A dificuldade natural para o tratamento dessas doenças, aliadas ao surgimento de cepas resistentes, requer técnicas de tratamento mais eficazes. Descobertas como a formação de biofilme protetor [20] e a função de uma recém descoberta fosforibosiltransferase [21], um tipo de transferase, apresentam novos alvos para drogas antimicrobacterianas. A popularização do sistema CRISPR também mostra uma possível nova abordagem para a identificação e eliminação de micobactérias, em especial Mycobacterium tuberculosis.[22][23]

Espécies[editar | editar código-fonte]

Referências

  1. a b Trabulsi, Luiz Rachid (2008 - 5ª edição). Microbiologia Atheneu [S.l.] 
  2. Madigan, Michael T. (12ª edição). Microbiologia de Brock [S.l.: s.n.] 
  3. «MeSH Pharmacological Classification». 
  4. «Lowenstein Jensen (LJ) Medium : Composition, Preparation, Method of Use and Pictures». 
  5. «Mycobacterium tuberculosis». 
  6. «Mycobacterium leprae». 
  7. «Gênero Mycobacterium spp» (PDF). 
  8. «Níveis de Biossegurança». 
  9. «Classificação de riscos de agentes biológicos» (PDF). 
  10. «Manual de biossegurança para laboratórios da tuberculose» (PDF). 
  11. «A Bacteriophage for Mycobacterium smegmatis.∗». 
  12. «Actinobacteriophage Database». 
  13. «Expanding the Diversity of Mycobacteriophages: Insights into Genome Architecture and Evolution». 
  14. «Phage typing report of 125 strains of "Mycobacterium tuberculosis». 
  15. «Introduction of foreign DNA into mycobacteria using a shuttle phasmid». 
  16. WR, Jacobs Jr (2000). Molecular Genetics of the Mycobacteria (Washington [s.n.]). 
  17. «Generation of a Novel Nucleic Acid-Based Reporter System To Detect Phenotypic Susceptibility to Antibiotics in Mycobacterium tuberculosis». 
  18. «In vivo efficacy of phage therapy for Mycobacterium avium infection as delivered by a nonvirulent mycobacterium». 
  19. Grange, J. M. World. Microbiol Biotechnol [S.l.: s.n.] 
  20. «Targeting drug tolerance in mycobacteria: a perspective from mycobacterial biofilms». 
  21. «A mycobacterial phosphoribosyltransferase promotes bacillary survival by inhibiting oxidative stress and autophagy pathways in macrophages and zebrafish». 
  22. «Fighting tuberculosis with modern weapons». 
  23. «Fighting against tuberculosis». 
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