Técnica de Ziehl-Neelsen

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Mycobacterium tuberculosis corado com a técnica de Ziehl-Neelsen

A coloração ou técnica de Ziehl-Neelsen, abreviada na literatura muitas vezes como ZN, é uma técnica de coloração de bactérias mais agressiva que a técnica de Gram, sendo usada em bactérias que não são bem coradas com esta técnica, como os bacilos da lepra e da tuberculose, as bactérias dos gêneros Mycobacterium e Nocardia, entre outros. Foi desenvolvida por Franz Ziehl e posteriormente melhorada por Friedrich Neelsen, no final do século XIX.[1][2][3][4]

Técnica de Ziehl-Neelsen[editar | editar código-fonte]

Há bactérias que são resistentes à coloração, mas que uma vez coradas vão resistir fortemente à descoloração, mesmo por ácidos fortes diluídos e álcool absoluto. Às bactérias que possuem esta propriedade dizemos que são ácido-álcool resistentes, (BAAR) (géneros Mycobacterium e Nocardia). Esta característica é devida ao elevado teor de lípidos estruturais (ex. ácido micólico) na parede celular destas bactérias, que provoca uma grande hidrofobicidade, dificultando a ação dos mordentes e diferenciadores de corantes aquosos.

A técnica de Ziehl-Neelsen evidencia esta ácido-álcool resistência. Segue o seguinte protocolo:

  1. Confeccionar o esfregaço seguindo as técnicas atuais de biossegurança;
  2. Cobrir a lâmina com fucsina fenicada (o mordente é o ácido fénico);
  3. Aquecer a lâmina até à emissão de vapores (é importante não deixar ferver);
  4. Aguardar 5 a 8 minutos;
  5. Lavar com água corrente;
  6. Cobrir a lâmina com álcool-ácido 3% até descorar totalmente o esfregaço;
  7. Lavar com água corrente;
  8. Cobrir a lâmina com azul de metileno durante 1 minuto;
  9. Lavar com água corrente;
  10. Secar;
  11. Observar.

A fucsina fenicada, atuando a quente, vai corar todas as células bacterianas e outras estruturas presentes no esfregaço de vermelho (o calor vai derreter os lípidos de membrana, tornando-a permeável). O ácido diluído em álcool aplicados vão descorar todas as bactérias exceto as ácido-álcool resistentes, que permanecem coradas de vermelho pela fucsina. Assim, ao serem observadas após coloração e contraste, com azul de metileno, encontraremos as bactérias:

  • Ácido-álcool resistentes: coradas de vermelho.
  • Não ácido-álcool resistentes: coradas de azul.

Preparação para a Coloração[editar | editar código-fonte]

Na observação microscópica pós coloração o material a observar deve ser previamente fixado, o que facilita a observação de bactérias, uma vez que têm reduzidas dimensões, fraco contraste e algumas refringência e mobilidade.

A fixação é a coagulação do protoplasma bacteriano com o mínimo de deformação e sua colagem à lâmina. Como exemplos de agentes fixadores temos o calor, o formol e o éter.

A coloração recorre do uso de corantes e permite aumentar o contraste e evidenciar a estrutura bacteriana. Estes são compostos orgânicos, com um ou mais anéis benzénicos que se encontram ligados a dois grupos funcionais, o cromóforo que é responsável pela cor do corante e o auxócromo que se dissocia ionicamente em solução dotando o corante de capacidade para reagir com os tecidos, células e estruturas celulares. Podemos diferenciar dois tipos de corantes; os corantes ácidos (são negativos formando sais com cátions) e os corantes básicos (são positivos formando sais com ânions). Como as bactérias possuem carga elétrica negativa existe afinidade entre os corantes básicos e as estruturas celulares da bactéria permitindo que esta fique corada. Para reforçar a ação do corante, aumentando a força de ligação deste às estruturas celulares utilizam-se mordentes como o ácido tânico, o ácido crômico, o ácido fénico, o iodo (Soluto de Lugol), o calor e os álcalis. Os solutos corantes são compostos de várias substâncias sendo geralmente hidro-alcoólicos-fenicados porque além da substância corante possuem água para permitir a dissociação iônica do corante, álcool para conservar e ácido fénico que atua como mordente e como bacteriostático evitando a contaminação das soluções corantes. Após a aplicação do corante aplica-se um diferenciador que serve para retirar o excesso de corante (acetona, ácido sulfúrico, álcool 95º). Os diferenciadores têm a capacidade de descorar certas bactérias já previamente coradas e são usados em colorações policromáticas.

A preparação de colorações policromáticas segue um protocolo constante. Assim, sobre um esfregaço (células fixadas pelo calor), aplica-se:

  1. O primeiro corante
  2. O mordente
  3. O diferenciador
  4. Água (vai parar a diferenciação)
  5. O segundo corante (vai ser contrastante)

Aplicações[editar | editar código-fonte]

As técnicas de coloração ácido-resistente, desenvolvidas inicialmente por Paul Ehrlich se baseiam na presença de ácidos micólicos, como as voltadas para a identificação do Mycobacterium tuberculosis[5] pela coloração de Ziehl Neilsen[6] e Kinyoun.[7]

Os esporos de Encephalitozoon cuniculi são coloridos com a coloração de Ziehl-Neelsen, os quais também apresentam afinidade com fucsina e azul de toluidina e a coloração azul de toluidina-fucsina.[8]

A coloração de Ziehl-Neelsen também encontra aplicação no diagnóstico de um fungo causador de dermatites assim como de feohifomicoses chamado Curvularia lunata.[9]

Referências

  1. Vinicius Mussi; Coloração de Ziehl-Neelsen - www.ageracaociencia.com
  2. Baron S, editor.; Medical Microbiology. 4th edition.; David N. McMurray.; Chapter 33 Mycobacteria and Nocardia; Galveston (TX): University of Texas Medical Branch at Galveston; 1996.
  3. Martin Gengenbacher, and Stefan H. E. Kaufmann; Mycobacterium tuberculosis: Success through dormancy; FEMS Microbiol Rev. 2012 May; 36(3): 514–532. doi: 10.1111/j.1574-6976.2012.00331.x
  4. SILVANA TRIFIRO, ANNE-MARIE BOURGAULT, FRANÇOIS LEBEL, AND PIERRE RENÉ; Ghost Mycobacteria on Gram Stain; JOURNAL OF CLINICAL MICROBIOLOGY, Jan. 1990, Vol. 28, No. 1, p. 146-147 - 0095-1137/90/010146-02$02.00/0
  5. Coloração de bactérias - Estudo da forma e organização das bactérias. - www.uma.pt
  6. Métodos de Coloração Bacteriana - estudmed.com.sapo.pt
  7. PESQUISA DE BACILO ÁLCOOL - ÁCIDO RESISTENTE – BAAR - www.pncq.org.br
  8. Maria Anete Lallo Eduardo Fernandes Bondan José Guilherme Xavier Marisa Porta Miche Hirschfeld; Técnicas de coloração para detecção de Encephalitozoon cuniculi em cortes histológicos; Ciência Rural, Santa Maria, Online - ISSN 0103-8478
  9. Adesh shrivastavaa, Karuna Tadepallib, Garima Goelc, Kajal Guptab, Pradeep Kumar Guptab; Melanized fungus as an Epidural abscess: A diagnostic and therapeutic challenge; Medical Mycology Case Reports, Volume 16, June 2017, Pages 20–24.

Ligações externas[editar | editar código-fonte]

Ver também[editar | editar código-fonte]