ChIP-seq
ChIP-seq é um método utilizado para analisar a interação de proteínas com o DNA. ChIP-seq combina imunoprecipitação da cromatina (ChIP) com sequenciamento de DNA massivamente paralelo para identificar os sítios de ligação de DNA associado a proteínas. Ele pode ser usado para mapear com precisão os sítios de ligação de qualquer proteína de interesse no genoma. Anteriormente, o método mais popular para estabelecer interações DNA-proteína era ChIP-on-chip, que combina a imunoprecipitação da cromatina com a hibridação em microarranjos de DNA [1]
Usos[editar | editar código-fonte]
O principal uso de ChIP-seq é estudar o efeito de fatores de transcrição e outras proteínas ligadas ao DNA no fenótipo. [2] Determinar como as proteínas interagem com o DNA para regular a expressão do gene é essencial para a plena compreensão de muitos processos biológicos e estados de doença. Estas informações epigenéticas são complementares para o genótipo e análise de expressão. ChIP-seq é uma alternativa para ChIP-chip, que requer uma matriz de hibridação e necessariamente introduz um viés, pois uma matriz é restrito a um número fixo de sondas.
Sítios específicos de DNA em interação física direta com fatores de transcrição e outras proteínas podem ser isoladas por imunoprecipitação da cromatina. Através de ChIP é produzida uma biblioteca de sítios de DNA alvo ligados a uma proteína de interesse in vivo. Análises do sequenciamento massivamente paralelo são utilizadas em conjunto com bases de dados de genomas completos para analisar o padrão de interação de qualquer proteína com o DNA, [3] ou o padrão de qualquer modificação epigenética da cromatina. Isso pode ser aplicado para o conjunto "ChIP'ável" de proteínas e modificações, tais como fatores de transcrição, polimerases e maquinário de transcrição, proteínas estruturais, modificações proteicas, e de modificações do DNA.[4]
Metodologia[editar | editar código-fonte]
Imunoprecipitação cromatina (ChIP)[editar | editar código-fonte]
A imunoprecipitação por cromatina é um método utilizado para a acumulação específica de sequências de ADN curtas associadas à proteína de interesse em células vivas células vivas.[5] Um procedimento típico inclui as seguintes etapas:
- Formação de ligações cruzadas reversíveis entre DNA e proteínas interagindo com ele
- Isolamento de DNA e clivagem em fragmentos por ultra-sonografia ou endonucleases
- Precipitação por anticorpos específicos contra a proteína de interesse
- Destruição de ligações cruzadas entre proteína e DNA, purificação de DNA
Como resultado, é possível identificar especificamente os fragmentos de DNA com os quais a proteína em estudo estava ligada.
Essa técnica tem várias limitações. Portanto, geralmente para a ChIP, é necessário um número significativo de células (cerca de 10 milhões), o que dificulta a utilização desse método em organismos modelo pequenos e também limita o número de experimentos que podem ser realizados com uma amostra valiosa. Um número de métodos foi desenvolvido para superar esta limitação, por exemplo Nano-ChIP-seq [6]
Referências[editar | editar código-fonte]
- ↑ Park, Peter J. “ChIP-Seq: Advantages and Challenges of a Maturing Technology.” Nature Reviews. Genetics 10, no. 10 (October 2009): 669–80. https://doi.org/10.1038/nrg2641.
- ↑ Furey, Terrence S. “ChIP–Seq and beyond: New and Improved Methodologies to Detect and Characterize Protein–DNA Interactions.” Nature Reviews Genetics 13, no. 12 (December 2012): 840–52. https://doi.org/10.1038/nrg3306.
- ↑ Johnson, D. S., A. Mortazavi, R. M. Myers, and B. Wold. “Genome-Wide Mapping of in Vivo Protein-DNA Interactions.” Science 316, no. 5830 (June 8, 2007): 1497–1502. https://doi.org/10.1126/science.1141319.
- ↑ http://www.illumina.com/Documents/products/datasheets/datasheet_chip_sequence.pdf
- ↑ Kaboord, Barbara, and Maria Perr. “Isolation of Proteins and Protein Complexes by Immunoprecipitation.” Methods in Molecular Biology (Clifton, N.J.) 424 (2008): 349–64. https://doi.org/10.1007/978-1-60327-064-9_27.
- ↑ Adli, Mazhar, and Bradley E Bernstein. “Whole-Genome Chromatin Profiling from Limited Numbers of Cells Using Nano-ChIP-Seq.” Nature Protocols 6, no. 10 (October 2011): 1656–68. https://doi.org/10.1038/nprot.2011.402.