Cromatografia gasosa bidimensional abrangente GCxGC

A cromatografia gasosa bidimensional abrangente GCxGC (do inglês "comprehensive two-dimensional gas chromatography") é uma técnica descrita originalmente em 1991 pelo professor John B. Phillips e seu aluno Zaiyou Liu. Desde então a GC×GC vem sendo extensivamente aplicada para solucionar problemas complexos de separações. Alguns dos grupos de pesquisa mais bem consolidados no mundo nessa técnica são encontrados na Austrália, Itália, Holanda, Canadá, Estados Unidos e no Brasil.

Utilizando-se a GC×GC, otimiza-se o poder de separação de um sistema de cromatografia gasosa acoplando-se duas colunas independentes que têm seletividades distintas. Assim, o eluente da primeira coluna, de tamanho convencional, é conduzido para a segunda, mais curta, através de um modulador, que tem como funções principais segmentar e focalizar frações do efluente da primeira coluna e, após a focalização, liberá-lo para a segunda coluna.

No Brasil a GC×GC foi primeiramente introduzida pelo Professor Fabio Augusto no Instituto de Química da Universidade Estadual de Campinas.

Importância

Em uma análise cromatográfica convencional, muitas amostras apresentam uma grande quantidade de compostos que não são separados tão facilmente, mesmo utilizando diferentes parâmetros de programação no equipamento. Reflexo disso é a sobreposição de picos e a baixa relação sinal/ruído. Para minimizar este problema, dependendo da matriz e equipamento de análise, são utilizados procedimentos de preparo de amostra, que em alguns casos utilizam solventes e nem sempre conseguem extrair de forma eficaz os analitos de interesse, torna o tempo dispendioso e prejudica o meio ambiente.

Para esta situação a cromatografia gasosa bidimensional abrangente (GCxGC) surge como uma importante técnica de separação, frente as demais técnicas cromatográficas, por possuir maior capacidade de separação, tornando-a uma poderosa técnica analítica para separação dos constituintes de uma matriz complexa, tais como, análise metabolômica, lipidômica, petroleômica, combustíveis, alimentos, óleos essenciais e análise forense.

A GCxGC utiliza duas colunas cromatográficas com forma e mecanismo de separação independente, sendo a primeira com comprimento maior do que a segunda e com um modulador entre as duas colunas. Diferentemente da cromatografia bidimensional (GC-GC), na qual ocorre a seleção do corte do efluente “heartcut” da primeira coluna, a GCxGC utiliza frações do efluente da primeira coluna, passa pelo processo de modulação e transfere para uma rápida separação na coluna secundária.

Em um sistema GCxGC  a primeira coluna normalmente é apolar e a segunda é polar. A ordem inversa também é possível. As colunas podem estar localizadas no mesmo forno ou em compartimentos diferentes, permitindo assim maior controle de temperatura. Para a análise de uma amostra complexa o conceito de capacidade de pico (n_c) deve ser considerado e representa a quantidade de sinais que pode ser colocado em um cromatograma com certa resolução e um determinado intervalo de tempo.

A capacidade de pico teórico de um sistema corresponde a soma da capacidade de picos para cada coluna. Em um sistema GC-GC para cada heartcut a contribuição de cada análise é em relação ao n_c e precisa ser levado em consideração

Equação

Onde: n_i representa a capacidade de pico de cada coluna; m representa o número de colunas utilizadas; n_c representa a capacidade de pico médio.

Em um sistema GCxGC a capacidade de pico corresponde ao produto das colunas individuais, tornando-a assim uma importante técnica com alta capacidade de pico em relação a outros arranjos bidimensionais.

Equação

Normalmente um pico largo, separado na primeira dimensão, corresponde à soma de dois ou mais compostos que ao passar pelo processo de modulação, obtém-se um cromatograma com o sinal dos compostos correspondente a esse pico largo. O cromatograma obtido a partir de uma análise GCxGC apresenta diferença em relação a uma separação cromatográfica convencional e possibilita a identificação de mais compostos desconhecidos. O resultado final da análise corresponde a um grande número de cromatogramas obtidos na segunda dimensão que facilita a identificação de compostos pertencentes a certos grupos.

Modulação: o processo

Na GC×GC duas colunas são conectadas sequencialmente, sendo a coluna da ¹D de dimensões convencionais e a da ²D mais curta (do tipo de coluna usada em cromatografia gasosa rápida), havendo um modulador posicionado entre elas. A função do modulador pode ser dividida em três processos:

• coletar ou amostrar continuamente frações pequenas do eluente da ¹D, garantindo que a separação nessa dimensão seja mantida;
• reconcentrar ou focalizar o eluente da ¹D em uma banda estreita e,
• transferir rapidamente para a ²D a fração coletada e focalizada como um pulso estreito. O conjunto dessas três etapas é denominado ciclo de modulação, que é repetido durante toda a corrida cromatográfica.

O tempo necessário para realizar um ciclo é denominado período de modulação (PM), o qual tem duração típica entre 2 s e 10 s e está relacionado ao tempo necessário para que os compostos sejam eluídos na ²D.

Outro aspecto fundamental de GC×GC que pode ser destacado é que a reconcentração do efluente da ¹D, que ocorre durante a modulação, ocasiona um aumento significativo da sensibilidade. O processo de modulação faz com que as bandas cromatográficas em sistemas GC×GC sejam 10 a 50 vezes mais estreitas que em ¹D-GC, resultando em valores para a 2wb entre 50 ms a 500 ms, o que exige detectores com resposta rápida e pequenos volumes internos.

Injetores

SPME

Nos métodos cromatográficos podemos nos deparar com amostras não compatíveis com o sistema cromatográfico onde a separação ou detecção só é possível se houver um preparo de amostra preliminar. A etapa do preparo de amostra é muito importante para que sejam alcançados resultados confiáveis e reprodutíveis. O conceito básico desta etapa é converter uma matriz real em uma amostra adequada para a análise. Para que esta etapa seja bem sucedida é necessário entender todo o processo de análise de um componente específico de uma amostra, incluindo suas propriedades físico químicas, condições ambientais e os componentes da matriz da amostra. As técnicas empregadas para o preparo de amostra segundo modelos de transferência de massa podem ser divididas em: extração em equilíbrio e pré-equilíbrio em sistemas de fluxo, extração em pré-equilíbrio em batelada e extração exaustiva e não exaustiva em estado estacionário. Dentre todas as técnicas de extração, sendo ela exaustiva ou não exaustiva, há um princípio termodinâmico fundamental em comum envolvendo o equilíbrio do analito na fase extratora e na amostra. Este equilíbrio, baseado na afinidade do analito com a fase extratora, é representado pela constante de distribuição, K_es, calculado pela razão da atividade do analito na fase extratora e na matriz, a_e e a_s respectivamente, podendo ser substituído por suas devidas concentrações, C_e e C_s.

$K_{es}={\frac {a_{e}}{a_{s}}}={\frac {C_{e}}{C_{s}}}$

Se a fase extratora for um sólido podemos descrever a constante de distribuição (K^s_es) pela razão entre a concentração de analitos adsorvidos na superfície da fase extratora, S_e, e a concentração de analitos na matriz da amostra, C_s.

$K_{es}^{s}={\frac {S_{e}}{C_{s}}}$

O SPME do inglês “solid phase micro-extraction” é um método de preparo de amostra introduzida por Pawliszyn em 1989 classificado como técnica não exaustiva de rápida extração e livre de solventes. A técnica basicamente consiste em expor uma pequena quantidade de fase extratora, associada a uma fibra, a uma amostra por um determinado tempo. Assim que a fibra entra em contato com o analito inicia-se uma difusão progressiva do analito no revestimento da fibra até que o equilíbrio seja atingido. Esta relação de massa do analito extraído pelo tempo de exposição da fibra compõe o que chamamos de Perfil de Extração.  Algumas condições de extração, como por exemplo, temperatura, pH, agitação, salting out e solventes orgânicos em água podem afetar a constante de distribuição e consequentemente o perfil de extração. O processo de microextração é considerado completo quando a concentração de analito atinge o equilíbrio entre a matriz da amostra e o revestimento da fibra. Três modos de extração podem ser realizadas utilizando SPME: extração direta, headspace e extração envolvendo uma membrana protetora.

No modo de extração direta a fibra é inserida dentro da amostra e os analitos passam da matriz da amostra para a fase extratora. Para facilitar a extração, a agitação pode melhorar o transporte do analito da amostra para a fibra. No caso do headspace, apenas analitos voláteis e semi-voláteis são extraídos, a fibra fica acima da matriz da amostra na região do headspace. Esta técnica é muito vantajosa quando se trabalha com interferentes de alto peso molecular. Em amostras contendo compostos não voláteis e interferentes de alto peso molecular a aplicação direta ou SPME headspace pode não ser efetivo. Nestes casos o uso de SPME com membranas protetoras resultam em uma melhor reprodutibilidade e precisão. Nas últimas décadas a implementação do SPME no preparo de amostras trouxe muitos progressos. O volume de fase extratora é bem menor se comparado com a técnica LLE (do inglês liquid liquid extraction) e este volume reduzido resulta em um isolamento relativo mais seletivo de analitos.

Devido a sua característica “solvent-free” e o tamanho da sua fibra ou capilar, o SPME pode ser conveniente a diversos instrumentos analíticos, já que sua sensibilidade é alta. A cromatografia gasosa é o método analítico mais frequentemente utilizado em conjunto com o SPME onde os analitos adsorvidos são introduzidos no injetor, injetores como SSL, por exemplo, podem ser utilizados com o SPME. A dessorção dos analitos é bem rápida devido a temperatura do injetor, que promove um decréscimo significativo na constante de distribuição e um aumento do coeficiente de difusão.

Podemos encontrar outros tipos de injetores projetados para uso com SPME. A utilização de um injetor dedicado para rápidas injeções pode fornecer tempos mais rápidos de separação e uma zona de injeção mais nítida devido a rápida injeção, este tipo de injetor permanece frio durante a introdução da agulha e aquece rapidamente quando a fibra é exposta ao gás de arraste. A fibra também pode ser desenvolvida para que não seja necessário o uso do injetor, contendo elementos que aquecem no seu interior, desta forma a fibra pode ser introduzida diretamente na coluna para que os analitos sejam dessorvidos. Uma outra alternativa são os injetores de dessorção flash desenvolvidos utilizando corrente diretamente na fibra. Este tipo de injetor só é possível se a haste for feita de material condutor, quando as conexões elétricas são feitas na parte interna da interface a fibra é rapidamente aquecida por uma descarga de corrente capacitiva. Injetores de dessorção flash podem ser aplicados como interface direta com uma variedade de equipamentos de detecção como, por exemplo, espectrômetro de massas e emissão atômica.

A primeira versão comercial de injetor automático de um cromatógrafo a gás com capacidade para SPME surgiu em 1993. Inicialmente os modelos desenvolvidos atuavam de forma estática sem controle de temperatura e um dos maiores desafios em projetar SPME automático é incorporar o controle de agitação e temperatura, assim como outras melhorias, como resfriamento interno da fibra ou injetores dedicados. Atualmente os injetores automáticos já possuem capacidades adicionais como controle individual de temperatura das amostras e agitação que permite o “bake-out” da fibra do SPME fora da porta de injeção. As técnicas mais comumente utilizadas para agitação da amostra em SPME automático são: vibração da fibra, rotação de bandeja e oscilação da bandeja. Por outro lado, em operações com fibra de SPME manual utiliza-se a agitação magnética. A vantagem das técnicas utilizadas nos processos automáticos é a não inserção de objetos externos na amostra, diminuindo a chance de contaminação, porém essas técnicas possuem algumas restrições. A agitação da fibra é mais eficiente em volumes pequenos e as técnicas de rotação e oscilação podem gerar um estresse na fibra se a velocidade não for controlada.

Em qualquer aplicação SPME em cromatografia gasosa a perfuração do septo pode se tornar um problema quando se utiliza septos tradicionais de CG, principalmente em métodos automatizados, de alto rendimento e com baixa supervisão, devido ao calibre diferente da agulha tradicional para CG e da agulha do SPME. Este problema pode ser facilmente resolvido trocando o septo para um de uso adequado ou utilizando um equipamento para injeção sem septo, estes equipamentos possuem um sistema de vedação durante a injeção e separação dos componentes da amostra. Para aumentar a robustez da fibra foi desenvolvido uma fibra de metal super elástico, o conjunto da agulha e fibra são feitos com liga inerte e flexível que fornece maior robustez e permite a realização de centenas de análises sem que a fibra seja danificada. Algumas fibras requerem um condicionamento inicial em temperaturas adequadas de acordo com o fabricante, para isso foi projetada um condicionamento de fibra de SPME autônoma permitindo o condicionamento rápido da fibra com altas temperaturas e fluxo de gás para a dessorção e posterior purga de contaminantes.

A configuração em fibra não é a única forma de SPME que vem sendo utilizada de forma automática acoplado a um CG. O dispositivo “in-tube” onde a extração é feita no interior de uma agulha também foi automatizada, sendo comercializada desde 2000 com o nome SPDE, do inlgês “solid-phase dynamic extraction”. O dispositivo é montado em uma seringa e, por repetição de puxar e pressionar o êmbolo, a amostra é coletada pela fase extratora. Para uma dessorção efetiva do analito no cromatógrafo, a fase gasosa flui através da fase de extração até a porta de injeção, isso é alcançado utilizando nitrogênio podendo ser aspirado dentro da seringa imediatamente antes da injeção ou adicionado através de uma entrada na lateral da seringa. Esta configuração do SPME possui um volume maior de fase extratora e é capaz de realizar mais análises do que o SPME por fibra, porém uma limitação da técnica é a utilização de agitação magnética, pois a agulha não pode ser tensionada.

Aplicações

A técnica de SPME vem sendo implementada em diversas áreas como agricultura, indústria alimentícia, análises biológicas, estudos ambientais, etc.

O uso dessa técnica tem sido essencial no estudo de metabólitos, já que métodos tradicionais de amostragem e preparo de amostras podem resultar em alterações no perfil metabolômico devido a uma multiplicidade de fatores como decomposições e interconversões de metabólitos, perdas de metabólitos voláteis, entre outros. Uma amostragem via SPME de imersão direta in vivo acoplada ao CGxCG-TOFMS foi empregada para analisar mudanças em tempo real no metaboloma de maçãs “Honeycrisp” durante seu amadurecimento nas árvores. Pela primeira vez, alcalóides de Amaryllidaceae, metabólitos com atividades biológicas importantes, incluindo anticancerígenos, antivirais, antiparasitária e inibidores de acetilcolinesterase (AChE) foram detectados em maçãs.

A técnica também é comumente utilizada em análises de aromas, principalmente em alimentos, já que a sensação do sabor é um fator chave que define o sucesso e aceitação do produto. Um método analítico baseado em SPME headspace combinado com CGxCG-TOFMS foi capaz de caracterizar compostos voláteis sulforados (VSCs, do inglês volatile sulfur compounds) em Baijiu do tipo “Aroma de Molho de Soja”. O nome Baijiu é derivado do chinês e refere-se a uma bebida forte, alcoólica e transparente. O Baijiu do tipo Aroma de Molho de Soja, também conhecido como Moutai, é um dos mais famosos Baijius na China. Com esse método foram identificados e quantificados dezenove tipos de VSCs, em particular, a presença de dissulfeto de metil furfuril e 2-metil3-(metildisulfanil)furano podem ser contribuintes importantes para o aroma da bebida.

Colunas

Em relação as conjunto de colunas as mais utilizadas são os conjuntos:

• Arranjo normal: primeira dimensão (¹D) apolar e segunda dimensão (²D) polar;
• Arranjo inverso: ¹D polar e ²D apolar;
• Arranjo com colunas quirais: ¹D quiral e ²D polar;

As colunas tipicamente utilizadas são: HP-5 (95% polidimetilasiloxano), SPWax (polietilenoglicol), HP-50 (polimetilfenilsiloxano) e quirais (ß-ciclodextrina). Deve ser ressaltado que os fabricantes utilizam nomenclaturas diferentes para fases estacionárias.

Arranjo inverso

No contexto da cromatografia gasosa existem mais de uma técnica para garantia da seletividade da coluna cromatográfica, sendo uma delas a coluna de arranjo normal, que foi detalhada no tópico anterior, e o arranjo inverso ou fase reversa como também é comumente denominado. Antes de entrarmos propriamente na explicação do arranjo inverso, aplicada a cromatografia gasosa bidimensional abrangente, é interessante o entendimento deste termo para a cromatografia convencional.

Para cromatografia convencional (GC) em fase reversa, a fase estacionária apresenta polaridade mais intensa ao comparado com a fase móvel, em vista disso as fases móveis em fase estacionária reversa apresentam maior concentração de solvente apolar. Outra característica a ser citada é quanto o fator de retenção da amostra (K), o mesmo aumenta para compostos mais hidrofílicos . Portanto, nesse tipo de coluna as moléculas hidrofílicas eluem primeiro enquanto que as moléculas hidrofóbicas eluem por último. Embora a cromatografia de fase reversa seja proposta como um método que pode ser aderido, o mesmo é menos utilizado devido a incompatibilidade de variedades de solventes com as fases de cromatografia gasosa.

A cromatografia gasosa bidimensional abrangente (GC × GC) é uma técnica de separação de alta resolução que possui em seu sistema duas colunas com seletividades distintas que admitem uma separação bidimensional das moléculas da amostra analisada. Em condições normais a coluna primária possui caráter não polar, sendo a segunda separação realizada por uma coluna polar. No entanto, para um sistema de coluna de fase reversa ocorre a inversão das polaridades das colunas, utilizando-se, portanto, colunas polar e apolar respectivamente para a primeira e segunda separação .

Para as configurações que adotam sistema apolar / polar ocorre maior resolução em solutos mais polares e substâncias que possuem maior massa molecular, entretanto no sistema de coluna reversa observa-se seletividade melhor para substâncias de baixa polaridade , sendo aplicável por exemplo para hidrocarbonetos naftênicos e compostos de heteroátomo polares. Mesmo que o conjunto de coluna normal seja geralmente o mais utilizado, o arranjo de colunas inverso oferece resultados bons para diversos tipos de amostras. A figura abaixo apresenta o sistema operacional de Varian modelo 3700 GC com um detector FID, em que a coluna primária (polar) mede 21 metros e 250 μm id (Supelcowax-10) e a segunda coluna secundária (não polar) de 1  m, 100  μm id (Quadrex-007), este é um exemplo do sistema de colunas de arranjo inverso em GC × GC.

Sistema de um Varian modelo 3700 GC com um detector FID

Aplicações

Para aplicar esta abordagem ZHU, avaliou o efeito da utilização de diferentes combinações de colunas da seletividade em GC × GC, tendo como amostra de estudo o licor chinês Moutai. As comparações ocorreram entre três combinações de colunas de conformidade “tipo reverso” (uma coluna polar como a primeira dimensão e uma não ou menos polar como a segunda dimensão) e uma coluna de configuração do tipo “normal”. Como o licor Moutai é composto principalmente por substâncias polares a citar álcoois, aldeídos, cetonas, ésteres e ácidos a combinação que se apresentou mais adequada para a separação cromatográfica foi a coluna de arranjo inverso.

Outro exemplo de aplicação pode ser observado no artigo Analyzing hydrocarbon fractions in crude oils by two-dimensional gas chromatography/time-of-flight mass spectrometry underreversed-phase column system, em que Li; Cao e Hu,analisaram compostos orgânicos em óleos crus com alta resolução e condição de coluna de fase normal e fase reversa usando cromatografia gasosa bidimensional / espectrometria de massa de tempo de voo (GC × GC / TOFMS), com o objetivo de avaliar a eficácia dos sistemas de colunas propostos para separação de hidrocarbonetos. Os autores verificaram que o sistema de coluna de fase reversa apresenta maior eficácia na separação de hidrocarbonetos ao ser comparado com a fase normal. Além disso, a fase reversa permite um adequado isolamento de biomarcadores de hidrocarbonetos saturados dos óleos crus avaliados.

Arranjo com colunas quirais

O uso de cromatografia gasosa bidimensional abrangente (GC×GC) aprimora a seletividade e sensibilidade do sistema cromatográfico adotado para a separação de isômeros. Isso deve-se ao fato de que é possível definir arranjos de colunas com seletividades diferenciadas como a escolha de fases estacionárias comuns em uma dimensão e fases próprias para isômeros em outra dimensão. Esta combinação de mecanismos de separação permite maximizar a separação de analitos em matrizes complexas. Além disso, é importante entender quais tipos de isomeria existem entre os componentes para a escolha do melhor arranjo de colunas nas diferentes dimensões.

A isomeria pode ser definida como moléculas de composição atômica idênticas, porém com diferentes arranjos de ligações dos átomos ou orientação dos átomos no espaço. Assim, substâncias de mesma formula molecular são chamadas de isômeros. Existem três tipos de isomeria: constitucional, configuracional e conformacional. Os isômeros constitucionais possuem a mesma composição atômica, porém arranjo de ligações diferentes, por exemplo, as moléculas catecol, resorcinol e hidroquinona, apesar de possuírem a mesma formula molecular, possuem posicionamentos distintos das hidroxilas ligadas ao anel aromático promovendo diferenças nas propriedades físico-químicas dos compostos. A isomeria conformacional está relacionada com a posição espacial de cada átomo na molécula, como as diferentes conformações que o ciclohexano pode assumir, cadeira ou barco. Por fim, a isomeria configuracional refere-se às relações geométricas entre átomos da molécula. Os diferentes exemplos deste grupo incluem as isomerias geométricas cis e trans em moléculas que apresentam insaturações, por exemplo cis- e trans-2-buteno ou diastereoisômeros, e a isomeria enantiomérica ou optica, cujo par de moléculas possui um ou mais centros quirais. Assim, dois isômeros enantioméricos são estruturas espelhadas uma da outra, ou seja não são sobreponíveis. Entre os diferentes exemplos de compostos que apresentam quiralidade, uma estrutura comumente estudada é o 2-butanol, que apresenta dois isômeros (+)-2-butanol e o (-)-2-butanol.

Conforme os isômeros constitucionais apresentam estruturas químicas diferentes, a escolha de uma coluna cromatográfica baseia-se na separação a partir da diferença de suas propriedades físico-químicas. Isômeros conformacionais possuem pequenas barreiras de energia para a interconversão entre as diferentes conformações, normalmente não são distinguíveis em cromatografia, portanto apresentam-se como um único pico no cromatograma. Entretanto, os isômeros configuracionais necessitam de fases estacionárias mais seletivas. No caso de isômeros cis e trans, ou diastereoisômeros, o uso de fases estacionárias mais polares e colunas mais longas promove uma melhor resolução cromatográfica, pois estes compostos apresentam pequenas diferenças físico-químicas que permitem sua separação ao longo da corrida. Para a separação de enantiômeros, moléculas que possuem as mesmas características físico-químicas, torna-se necessário o uso de fases estacionárias com enantiosseletividade, isto é, seletores quirais são necessários para interagir seletivamente com estes compostos e fornecer a resolução dos compostos.

O mecanismo da separação de enantiômeros provém da formação de complexos transientes de associação diastereoisomérica, isto é, a formação de diastereoisômeros por interação direta do enantiômero com a fase quiral, ou por reação química com um reagente de derivação. Portanto, a enantiosseletividade é obtida a partir da interação preferencial do seletor quiral com os enantiômeros. De acordo com a esquema abaixo (retirada de Poole), o enantiômero “I” indica que a enantiosseletividade advém de pelo menos três interações com o seletor quiral. Porém, o enantiômero “II” reproduz uma situação em que ocorre apenas duas interações com o seletor quiral. Por consequência, o enantiômero “I” forma um complexo mais estável com a fase estacionária que o enantiômero “II” e se essa estabilidade for suficiente, os dois enantiômeros serão separados, pois o enantiômero “II” ficará menos tempo retido na fase estacionária.

Contudo, este modelo não explica precisamente o mecanismo de separação de enantiômeros em polímeros quirais. Portanto, de forma complementar, existe o efeito de ajuste conformacional no início da formação do complexo diastereoisômérico, responsável pela diferença nas estabilidades dos complexos e, em seguida, pela separação dos enantiômeros.

Diversos tipos de fases estacionárias quirais são comercializadas e utilizadas atualmente, uma vez que a grande variedade de opções está relacionada com a grande quantidade de mecanismos de enantiosseletividade. A cromatografia gasosa para separação de enantiômeros apresenta três principais tipos de fases estacionárias: ciclodextrinas modificadas, complexos metálicos e aminoácidos modificados.

Ciclodextrinas

As ciclodextrinas são oligossacarídeos macrocíclicos naturais contendo seis (α-), sete (β-) ou oito (ℽ-) monômeros de D-glicose em conformação cadeira conectados por ligações α-(1,4). Os anéis de glicose são dispostos na forma de uma cavidade cone truncado, formando uma cavidade relativamente hidrofóbica e uma superfície externa polar na qual os grupos hidroxila estão localizados. As propriedades das ciclodextrinas naturais podem ser modificadas ao reagir as hidroxilas da superfície externa com vários grupos funcionais ou ao manipular o tamanho da abertura do anel de ciclodextrina, expandindo sua faixa de aplicação para separações de enantiômeros, e otimizando suas propriedades físicas para uso como fases estacionárias.

Inicialmente, os derivados de ciclodextrina natural enfrentaram dificuldades na questão de pontos de fusão desfavoráveis e temperaturas de decomposição baixas, porém a utilização de alguns derivados, por exemplo alquilados, no recobrimento de superfícies de vidro desativadas contribuíram para contornar estas dificuldades. Atualmente, o uso de derivados de ciclodextrina como fases estacionárias declinou nos últimos anos em favor de derivados de ciclodextrina dissolvidos ou quimicamente ligados a uma fase estacionária de polisiloxano, por exemplo, imobilizada em fase de cianopropil–polidimetilsiloxano. Essas fases geralmente possuem maior estabilidade térmica e mecânica, além de maior eficiência. As ciclodextrinas têm sido aplicadas com sucesso na separação de enantiômeros de diversas funções, como álcoois de baixa massa molecular, aminas, aminoácidos, epóxidos, ácidos carboxílicos, ésteres, lactonas, éteres, haloalcanos e hidrocarbonetos.

Aminoácidos

Os aminoácidos modificados são estruturas de baixo peso molecular e, geralmente, contêm um único ou poucos centros quirais próximos aos grupos substituintes que possuem interações de atração ou estéricas com os enantiômeros. Estes seletores quirais são relativamente pequenos e adequados para imobilização em sílica gel ou superfícies de vidro. Atualmente, o único exemplo disponível comercialmente é a fase de polimetilsiloxano contendo L-valina-f-butilamida (Chirasil-Val), que tem sido usada para separar uma ampla gama de aminoácidos racêmicos derivados, aminoálcoois, aminas, hidroxicetonas, 2-hidroxiácidos e seus ésteres, 3-hidroxiácidos, lactonas e sulfóxidos.

Complexos metálicos

A formação rápida e reversível de complexos de transferência de carga entre íons metálicos e compostos orgânicos que atuam como doadores de elétrons pode ser usada para ajustar a seletividade entre enantiômeros. O mecanismo de seletividade utiliza a diferença em constantes de estabilidade entre o composto de coordenação com metal e os analitos. Separações complexas de diastereoisômeros e enantiômeros podem ser realizadas por cromatografia de complexação. Exemplos de fases estacionárias deste tipo incluem algum metal bivalente (por exemplo, níquel, cobalto e manganês) com bis [3-(trifluoroacetil)-(lR)-canforato] e bis [3-(heptafluorobutanol)-(IR)-canforato] dissolvido ou incorporado em uma fase que não possui ação de coordenação de metais, tal como polidimetilsiloxano.

Aplicações

As colunas de ciclodextrinas modificadas são amplamente utilizadas para separações de enantiômeros em matrizes complexas como fragrâncias, aromas, alimentos e óleos essenciais.

Um exemplo disso é a separação de álcoois isômeros como 2- e 3-metilbutanol e ésteres como acetato de butila, ácido butanoico e o seu respectivo éster butanoato de etila, entre outros compostos dessas classes, que estão presentes no vinho em diferentes concentrações, variando de baixas concentrações como 0,8 µg L^-1 até altas concentrações como 490 mg L^-1. Estes compostos possivelmente contribuem para a qualidade sensorial do vinho, portanto diferenças nas concentrações dos isômeros podem proporcionar alterações no perfil aromático do vinho. Desta maneira, a correta identificação e quantificação desses compostos tornam-se importantes.

No estudo realizado por Shao e Marriott, optou-se por utilizar duas colunas na primeira dimensão recobertas com ciclodextrinas modificadas, EtTBS-β-CD (MeGA) e CycloSil-B. Além disso, diferentes arranjos de colunas para sistemas GC×GC foram testados para explorar a combinação que resulta na melhor resolução dos compostos alvo. Na primeira dimensão, o sistema com colunas quirais utilizou duas colunas conectadas em sequência. A primeira coluna EtTBS-β-CD (MeGA) 24m×0,25mm e 0,25 μm espessura do filme e a coluna CycloSil-B (fase 2,3-di-O-metil-6-O-t-butildimetilsilil)-β-ciclodextrina) 30m×0,25mm e 0,25 μm de espessura do filme. Na segunda dimensão, colunas do tipo BP20 (polietilenoglicol), BPX5 (5% Fenil metilpolisilfenileno), EtTBS-β-CD, e BPX50 (50% Fenil metilpolisilfenileno) foram testadas, todas com dimensões de 1m×0,1mm e 0,1 μm de espessura do filme. Após otimização do sistema cromatográfico, foi definido o uso do seguinte arranjo: Primeira dimensão, colunas MeGa conectada a CycloSil-B; Segunda dimensão, coluna BPX50. Os compostos foram detectados utilizando FID. Além disso, o método utilizou trap criogênico.

A melhoria na resolução dos picos cromatográficos devido ao uso da coluna de cilodextrina modificada pode ser observada nos cromatogramas a seguir:

No cromatograma obtido “A”, a separação cromatográfica utilizou uma coluna com fase estacionária aquiral (BPX5), é possível observar a co-eluição dos compostos ácidos 2- e 3-metilbutanoico. Entretanto, ao se utilizar uma coluna com fase estacionária de ciclodextrina modificada (MeGA CDD), demonstra-se um ganho na seletividade e, por consequência, na resolução dos picos dos enantiômeros.

Por fim, a partir dos cromatogramas abaixo, os autores apresentam as análises GC×GC com a mistura de padrões dos analitos de interesse apresentado em “A” e com uma amostra de headspace de vinho tinto Shiraz apresentado em “B”. Neste sentido, observamos uma resolução adequada para os compostos: 1, 2 e 3: isômeros ésteres 2- e 3- metilbutanoato de etila; 4, 5 e 6: isômeros ésteres acetatos de 2- e 3- metilbutila 10, 11 e 12: isômeros ácidos 2- e 3-metilbutanoico. Para os álcoois 7, 8 e 9: 2- e 3-metilbutanol não foi possível obter resolução adequada para (S) 2-metilbutanol e 3-metilbutanol. Além disso, na amostra real de vinho tinto foram identificados vários destes compostos com resolução adequada, comprovando assim a eficácia do método cromatográfico desenvolvido.

Outro exemplo de aplicação deste tipo de coluna para a separação de enantiômeros é a separação dos compostos presentes em óleos essenciais. O óleo de cardamomo é o principal componente aromatizante em vários produtos acabados que vão desde alimentos e bebidas, confeitaria, cosméticos, e também é conhecido por ser antioxidante e por possuir propriedades antimicrobianas. Cinco moléculas identificadas no óleo possuem maior impacto no aroma: limoneno, 1,8-cineol, β-mirceno, α-pineno e α-basabolol. Além destas, existem   outros compostos majoritários identificados no óleo: α-terpineol, nerolidol, 4-terpineol, δ-terpineol, δ-3-careno, germacreno D, α-terpineno e aldeído longifoleno. A correta caracterização destes componentes e seus isômeros quirais voláteis auxilia na identificação da origem, qualidade e possíveis adulterações deste óleo essencial.

Os autores utilizaram um sistema GC×GC-QTOFMS para análise de óleo essencial foi avaliado usando uma mistura padrão de monoterpeno quiral incluindo padrões de α- e β-pineno e limoneno, bem como óleo essencial de cardamomo como uma análise prática de amostra real. Na primeira dimensão foi adotada uma coluna enantiosseletiva (composta com uma ciclodextrina modificada) para resolver os quirais monoterpenos presentes na matriz complexa, sendo esta coluna definida como CHIRALDEX β-DM (fase 2,3-di-O-metil-6-t-butilsilil-β-ciclodextrina; 30m×0,25mm e 0,12 μm de espessura do filme). Várias fases estacionárias normais foram testadas na segunda dimensão, incluindo SLB-IL59, SLB-IL111, HP-88 e SUPELCOWAX. Após otimização do sistema cromatográfico, foi definido o uso do seguinte arranjo: Primeira dimensão, coluna CHIRALDEX β-DM; Segunda dimensão, coluna SLB-IL59. O trap criogênico foi utilizado para correto estabelecimento dos tempos de retenção na segunda dimensão.

O cromatograma A abaixo demonstra que em um caso de amostra real de óleo essencial de cardamomo, este arranjo de colunas e método cromatográfico foram suficientes para a correta separação e definição das razões entre os enantiômeros. Por fim, é possível observar a resolução completa dos picos cromatográficos de interesse no cromatograma B que apresenta a análise para a solução de compostos padrão. Neste caso, observa-se a correta separação dos compostos 1a: (-)-(S)-α-pineno, 1b: (+)-(R)-α-pineno, 2a: (+)-(R)-β-pineno, 2b: (-)-(S)-β-pineno, 3a: (+)-(S)-limoneno; 3b: (+)-(R)-limoneno, 4: p-cimeno, 5: p-cineol.

Detectores

A resposta produzida pelo detector é relativa aos compostos separados pela coluna cromatográfica, na forma gasosa. Após a separação dos compostos, fluxos limitados são direcionados ao detector, permanecendo por um tempo muito curto (alguns segundos), sendo assim, o detector deve ser eficiente para transformar a resposta obtida em sinal elétrico durante esse tempo. O detector pode ser usado para quantificar espécies definidas em uma amostra ou para fornecer informações estruturais sobre compostos específicos. Para isso, é necessário conhecer o funcionamento do detector o qual pretende-se usar, sabendo que o sinal é gerado em função de alguma propriedade física ou química dos compostos a serem analisados. Para obter os melhores resultados é interessante conhecer os parâmetros operacionais e os mecanismos de detecção de cada detector para obter as melhores respostas.

Um dos requisitos para o detector GCxGC, é a rapidez na aquisição das respostas. Devido a separação abrangente, as larguras das bases dos picos são na faixa de 50 a 200 ms, sendo necessário taxas de aquisição mínimas de 100 Hz. Em muitas aplicações, os detectores de GC são bem aplicáveis a GCxGC.Devido à pequena largura de pico na segunda dimensão são necessários detectores adequados. Por exemplo: detector por ionização em chama (FID), detector termoiônico (TID) e espectrométrico de massas com analisadores quadrupolares rápidos (Q) ou por tempo de voo (TOF).

FID

Dentre os detectores mais comuns, considerado universal, o detector com ionização por chama (do inglês, flame ionization detector - FID) possui taxa de aquisição com até 300 Hz de frequência e eficiência tanto para quantificar como para a identificar os picos nos gráficos 2D, pela relação entre a estrutura (já que o FID informa o número de carbonos efetivos do composto) e a retenção.

Princípio de Funcionamento

Esquema instrumental FID. Adaptado de Grob, 2004.

O detector FID, consiste em uma pequena chama de difusão de hidrogênio-ar a qual está posicionada no final da coluna cromatográfica. Após a separação, o gás transportador da coluna é direcionado para o interior da chama e os compostos orgânicos são queimados, gerando espécies carregadas. A mais de 300 V acima da chama é posicionado um eletrodo coletor, o qual atrai os íons gerados produzindo um aumento na corrente do eletrodo, referente aos compostos queimados na chama. A geração de íons na chama se dá em diferentes regiões. A mistura de gases (gás carreador, gás de makeup e hidrogênio) passa na ponta do jato em um determinado fluxo, gerando energia térmica. Ao se expandir, entra em contato com o ar que é injetado pela parte externa do jato, e devido a energia térmica produzida, a mistura de gases é pré-aquecida por retrodifusão.

Na região rica em H₂, os compostos orgânicos saídos da coluna são degradados, formando espécies únicas de carbono devido a mistura de gases do jato com o oxigênio do ar, as seguintes espécies são formadas:

CH^• + O^• → CHO⁺ + e^-

A espécie CHO⁺ reage rapidamente com a H₂O gerada na chama proveniente da queima dos compostos orgânicos, gerando novas espécies:

CHO⁺ + H2O → H₃O⁺ + CO

A espécie H₃O⁺ é a única carga positiva gerada, a qual vai ser atraída pelo eletrodo. A formação da espécie iônica ocorre uma vez a cada 10⁵ átomos de carbono introduzidos na chama, sendo possível relacionar a resposta do FID com o número de átomos de carbono.

Particularidades

O detector FID responde a compostos orgânicos que queimam na chama hidrogênio-ar. Isso porque a resposta dada pelo detector é em relação ao número de átomos de C por tempo. A altura do pico de resposta gerado é dividida pela massa de soluto injetada no cromatógrafo. O fator de resposta não é alterado com mudanças no fluxo do gás de arraste, porém é afetado pela presença de heteroatomos, como O, N e halogênios. Para que fosse possível a identificação de qualquer composto, foi inferido ao FID o número de carbonos efetivos (do inglês, effective carbon numbers - ECN) o qual explica o porquê compostos com heteroatomos diminuem o fator resposta no FID. Contribuições são adicionadas a átomos e grupos funcionais que alteram o fator de resposta dos compostos. Das particularidades do FID, destacam-se principalmente a alta faixa linear alcançada, em torno de 10⁷, e LDs na faixa de 10^-13 g C/s, além do baixo ruído. Baixos sinais de fundo (10^-13 A) são obtidos desde que os gases utilizados sejam de elevada pureza. Os gases tem grande influência também na sensibilidade, principalmente com as proporções e os tipos de gases utilizados. Quando utilizado N₂, por exemplo, como gás de makeup ou carreador a resposta do FID é maior. A proporção inicial indicada é utilizar 30 mL/min de H₂, gás carreador e gás de makeup enquanto que para o ar é indicado no mínimo um fluxo dez vezem maior, em torno de 300 a 500 mL/min.

Aplicações

O uso da GCxGC-FID é muito utilizada principalmente para a análise petroquímica, servindo como “impressão digital” na geoquímica, através da identificação estrutural de compostos. Como por exemplo, o número de carbonos nas estruturas de n-parafinas pode indicar a fonte de entrada da matéria orgânica. Números pares ou ímpares de carbono na estrutura do composto pode indicar a fonte de petróleo. Números pares de C, referem-se a óleos marinhos de fontes de carbonato, enquanto que números ímpares indicam óleo marinho de rochas de xisto.

Outra aplicação importante, são os aromas encontrados em perfumes, os quais são misturas muito complexas de vários compostos onde alguns estão em concentrações muito baixas (ng/L). Alguns grupos possuem estruturas relacionas e a necessidade de identificação estrutural em um cromatograma 2D facilita a identificação. Além disso, a identificação e quantificação de alérgenos em fragrâncias é de extrema importância, para controlar seus níveis em produtos cosméticos, de acordo com os órgãos regulamentadores.

NPD

O detector nitrogênio-fósforo (do inglês, Nitrogen-Phosphorus Detection – NPD) é classificado como um detector termoiônico (TID). Diferentemente do FID, detectores termoiônicos não são aquecidos diretamente, isto é, não apresentam chama, e a característica principal se torna a presença de uma cerâmica aquecida por corrente elétrica. Com a cerâmica em alta temperatura, forma-se um plasma localizado em sua superfície, o que favorece as reações de decomposição e de ionização.

Por não apresentar chama, o NPD possui maior eficiência de ionização e maior sensibilidade para compostos com nitrogênio e fósforo quando comparados com o FID. Para os dois parâmetros, o NPD pode ser até 10000 vezes melhor do que o FID.

Princípio de funcionamento

Frente a outros detectores, o NPD apresenta maior seletividade e, como consequência, diminui o ruído de fundo e se tem maior sensibilidade aos compostos de nitrogênio e de fósforo. Para que esta seletividade seja alcançada, tem-se o uso de uma cerâmica (pérola) específica – silicato de rubídio, localizada acima da saída de vapor da coluna capilar. Na figura abaixo se tem um esquema do NPD, onde a cerâmica está circulada em vermelho.

Esquema do NPD. Cerâmica se encontra destacada no círculo vermelho.

O seu princípio de funcionamento pode ser destacado em duas etapas: (a) no aquecimento elétrico (efeito Joule) da cerâmica, que está ligada a um fio de platina, onde se tem a passagem de uma corrente elétrica programada no software e, a partir disso, a cerâmica pode atingir altas temperaturas, entre 600 °C e 800 °C; (b) e na formação de um plasma localizado por meio do contato do gás hidrogênio e ar comprimido na superfície aquecida da cerâmica.

O gás hidrogênio e os gases de reposição (comumente chamados de gases de make-up) se misturam ao vapor da amostra, que sai da coluna capilar, dentro da região do jato. A partir disso, a mistura de gases sai do jato e se mistura ao ar comprimido; assim, ao entrarem em contato com a cerâmica aquecida, ocorre a formação do plasma, as reações de decomposição e de ionização dos compostos da amostra com nitrogênio e fósforo. Nesta etapa, torna-se fundamental a composição da cerâmica, pois é ela que promoverá a transferência de elétrons para compostos contendo N e P, gerando os íons negativos. Assim que os íons são formados, eles são direcionados para o eletrodo coletor, que é mantido a um potencial de algumas centenas de volts, e são detectados e quantificados.

O uso de gases de make-up se faz necessário para que não ocorra o alargamento dos picos cromatográficos. Neste caso, usam-se os gases de He e de N₂. Se a análise exigir uma maior sensibilidade, usa-se uma maior proporção de gás He. Entretanto, se for preciso uma maior estabilidade da linha de base, o gás em maior proporção a ser usado é o de N₂.

Particularidades

Ao se trabalhar com NPD, alguns parâmetros são ajustados para se atingir a seletividade e a especificidade necessárias para a análise. A especificidade do fósforo, quando vista através da vazão de gás hidrogênio, aumenta até certo valor de vazão e depois decresce. Enquanto a especificidade do nitrogênio é significativamente mais dependente das vazões dos gases e da corrente elétrica aplicada na cerâmica. Dessa forma, costuma-se otimizar a programação do NPD levando em consideração a especificidade do nitrogênio.

A temperatura do detector também influencia na seletividade e na sensibilidade, sendo recomendado trabalhar em altas temperaturas, entre 275 °C e 325 °C. Esta faixa também é usada para conservar a cerâmica.

A quantidade mínima detectável para o nitrogênio é de 0,5 - 1 pg e para o fósforo é de 0,1 - 0,5 pg, dependendo da estrutura do composto, das condições da cerâmica, das vazões dos gases e da temperatura do detector.

Uma outra particularidade referente a este tipo de detector está relacionada com a estabilização da linha de base do mesmo antes de se iniciar o processo de aquecimento da cerâmica. Este procedimento inicial se torna importante para aumentar a vida útil da cerâmica, uma vez que quanto mais desgastada for a cerâmica, menor será a taxa de resposta para os compostos analisados.

Aplicações

Como o NPD é específico para compostos que apresentam nitrogênio ou fósforo em suas estruturas químicas, pode-se destacar seu uso em petroquímica e na determinação de fungicidas organofosforados e organonitrogenados, onde muitos são carcinogênicos e neurotóxicos. A Agência de Proteção Ambiental dos Estados Unidos (do inglês, United States Environmental Protection Agency - USEPA) define alguns métodos para a determinação de pesticidas organofosforados fazendo uso do NPD, dentre eles tem o método 8141A.

Um estudo realizado por Khummueng et al. (2006) demonstrou o grande potencial para análises de rotina de fungicidas em alimentos por meio do uso de GCxGC-NPD. O grupo otimizou, analisou e confirmou baixos limites de detecção e de quantificação, além da boa reprodutibilidade e da boa repetibilidade do método.

VUV

O detector ultravioleta no vácuo (VUV - vacuum ultraviolet detector) foi desenvolvido recentemente como uma alternativa aos detectores de cromatografia de gás existentes. Historicamente, a análise no VUV foi mantida em instalações sincrotron com células de fluxo que estão sob vácuo, daí o nome. O vácuo pode ter sido usado para reduzir a absorção de fundo, como o ar e umidade, no entanto para medidas nesta faixa de comprimento de onda pode-se reduzir essa absorção de fundo usando gases como hélio, nitrogênio, argônio e hidrogênio.

Princípio de funcionamento

Este detector mede a absorção de espécies químicas da fase gasosa na faixa de 120–240 nm, onde todos os compostos químicos apresentam espectros de absorção únicos. Nesta faixa de comprimento de onda, as transições eletrônicas de alta energia que podem ser excitadas e sondadas são :

$\sigma \rightarrow \sigma *;n\rightarrow \sigma *;\pi \rightarrow \pi *;n\rightarrow \pi *$

A água e o oxigênio absorvem fortemente na região do UV, devido a isso o caminho óptico é purgado com nitrogênio ou gás nobre para reduzir a absorção de fundo, como descrito anteriormente. Desta forma, a análise qualitativa pode ser realizada e a quantificação segue os princípios da lei de Beer-Lambert. Essa técnica pode ser aplicada em diferentes campos, como petroquímica, alimentos e análise ambiental, isso porque normalmente possui a capacidade de deconvolução de analitos que coeluem. Um dos procedimentos usados para isso é o tratamento de dados por deconvolução de intervalo de tempo, que usa o conceito de absorção aditiva para analitos co-eluentes, possibilitando a classificação e especiação de misturas complexas.

Principio de funcionamento: Os analitos que são eluídos da coluna de GC são transportados para o detector VUV através de uma linha de transferência aquecida para evitar condensação. A radiação UV é fornecida por uma lâmpada de deutério. O sistema óptico focaliza a luz para a célula de fluxo. Depois de passar pela célula de fluxo, que é coberta por janelas de magnésio, a luz é difratada e é registrada a transmitância de todos os comprimentos de onda simultaneamente através de um detector de carga acoplada (CCD). Os gases de arraste da cromatografia gasosa têm absortividade relativamente baixa e podem ser facilmente subtraídos do fundo, dessa forma, as varreduras de fundo escuro e de fundo são coletadas no início de cada execução para subtração. Os analitos são identificados pela comparação dos espectros medidos com os espectros de referência de analito existentes presentes na biblioteca. Uma das características mais importantes do detector VUV é sua capacidade de deconvoluir espécies co-eluentes, podendo-se determinar as espécies individualmente, mesmo quando sobrepostos. Isso se deve a absorção aditiva,  na qual os picos sobrepostos dão um espectro que corresponde ao somatório de absorbância de cada composto, isso só falha quando espécies sobrepostas estivessem presentes em concentrações altas o suficiente para que interajam significativamente. Essa propriedade reduz a necessidade de usar coluna especiais para separar compostos que não são discriminados por outros detectores de GC comuns.

Particularidades

Esse detector por não ser destrutivo pode, em princípio, ser ligado em série antes de outra técnica de detecção. Além disso, comparando com o MS, que é atualmente o detector mais amplamente aplicável que pode fornecer informações qualitativas e quantitativas, o detector VUV possui recursos semelhantes.

O detector VUV é sensível à massa, ou seja, responde à quantidade de analito presente por unidade de tempo, devido a isso variações de fluxo não diluem o sinal. Considerando todas as características descritas juntamente com a rápida taxa de aquisição, adquirindo até 90 espectros de absorção de faixa completa por segundo, o acoplamento com GC X GC se torna adequado e vantajoso.

Na análise qualitativa, uma biblioteca de banco de dados é usada para a identificação dos compostos desconhecidos, combinando o espectro do analito com os espectros de referência, obtidos a partir da análise de soluções padrão. As formas dos espectros de referência dependem apenas da estrutura eletrônica e vibracional da molécula do analito e não da quantidade, e isso permite que sejam usados ​​para identificação de desconhecidos e para processos de deconvolução.

Na análise quantitativa, o detector VUV segue a Lei de Beer-Lambert: A = gbc

onde A é a absorbância, g é o coeficiente de absortividade molar (L mol^{− 1}cm ^{− 1}), b é o comprimento do caminho (cm) e c a concentração do analito (mol L ^{− 1}).

No contexto das técnicas de análise instrumental comuns, soluções padrão com concentrações conhecidas são usadas para gerar uma curva de calibração e uma equação de calibração, considerando as áreas ou alturas dos picos.

O detector VUV é capaz de fornecer tanto informações qualitativas quanto  quantitativas, enquanto muitos detectores como ECD, FID e TCD, não fornecem informações qualitativas. Outro fator interessante é que nenhuma ionização é necessária, tornando o VUV viável para analisar compostos lábeis que não podem ser analisados ​​por MS. O VUV apresenta limites de detecção nos níveis de picograma, tornando-o uma técnica competitiva quando comparado ao MSD, FID e outros.

Aplicações

O detector VUV deve auxiliar na análise de misturas altamente complexas, especialmente aquelas contendo um grande número de espécies isoméricas. Duas aplicações serão descritas a seguir.

No trabalho desenvolvido por Beate Gruber e colaboradores (2016)  temos o uso de GC X GC com o detector VUV, mostrando um estudo sobre suas as principais características, por meio da análise de compostos oxigenados pequenos que compõem os gases de respiração, como acetona, 2,3-butanodiona e acetona. É destacado a alta velocidade de aquisição e limites de detecção baixo, tornado o detector adequado para GC X GC. Um outro recurso promissor deste detector é o conceito de análise de dados de filtragem espectral, que permitem uma rápida categorização de cromatogramas para classes de compostos.

Outra aplicação é mostrada no trabalho desenvolvida por Mariosimone Zoccali e colaboradores (2017), em que foram usados os recursos do detector para a análise qualitativa e quantitativa de combustível biodiesel e diferentes tipos de ácidos graxos em GC X GC. Isso foi possível por meio dos princípios da lei de Beer. Esta forma de detecção pode abordar limitações específicas relacionadas à espectrometria de massa e também é capaz de deconvoluir picos de coeluição. Além disso, é possível explorar uma quantificação pseudo-absoluta de analitos com base em seções transversais de absorção pré-registradas para analitos alvo, sem a necessidade de calibração tradicional.

Hifenação/Acoplamento

QMS

Desde o surgimento da técnica de GCxGC, ela foi associada aos detectores por ionização em chama (FID), pois possuem alta taxa de aquisição (até 200Hz) e boa resposta a quase todos os compostos orgânicos, com boa performance em análises quantitativas. Porém, os detectores FID não fornecem informações estruturais, o que tornou a utilização de acoplamentos com analisadores de massa comum em análises de identificação e/ou confirmação de compostos.

Os princípios fundamentais da técnica de espectrometria de massas datam dos anos 1980, quando J. J. Thomson determinou a razão massa/carga do elétron e do estudo de Wien sobre a deflexão magnética de raios anódicos, determinando que os raios eram carregados positivamente. Entre os anos de 1912 e 1913, Thomson estudou o espectro de massas de gases atmosféricos, demonstrando assim a existência de isótopos.

Em 1918, o primeiro espectrômetro moderno foi desenvolvido por Arthur J. Dempster, que descobriu o isótopo ²³⁵U. Em 1919, Francis W. Aston também desenvolveu e melhorou seu espectrômetro de massas, descobrindo assim 212 isótopos naturais, o que lhe rendeu um Prêmio Nobel de Química em 1922. Os conceitos desenvolvidos por Dempster e Aston são utilizados até hoje no desenvolvimento dos modernos espectrômetros de massas.

Os íons gerados pelas fontes de ionização presentes nos analisadores de massa são separados de acordo com suas razões massa-carga (m/z). Existem diversos analisadores de massas que se diferenciam pelas características de construção e operação, assim como por seus benefícios e limitações. Um deles é o analisador de massas do tipo quadrupolo, que é bastante popular devido a sua simplicidade, preço relativamente baixo, boa linearidade em análises quantitativas e pela facilidade de operação.

O quadrupolo é composto por quatro barras de metal dispostas em dois pares. Um par é mantido sob um potencial elétrico positivo e o outro sob um potencial negativo. Assim, o par de barras positivo agirá como um filtro para íons de massas mais elevadas, enquanto o negativo será como um filtro para íons de massas menores. Dependendo das voltagens de radiofrequência e de corrente contínua aplicadas nas barras, somente íons com determinados m/z, que estarão em ressonância com o campo aplicado, irão passar pelo quadrupolo e chegar ao detector. Os íons com m/z diferentes terão trajetórias irregulares e atingirão as barras, sendo eliminados.

Devido a possibilidade de obtenção de informações estruturais dos compostos, surgiu o acoplamento GCxGC com espectrometria de massas com analisador quadrupolar (qMS). Porém, esse tipo de hifenação apresenta baixas taxas de aquisição (até 20Hz), o que representa uma taxa de 2 espectros de massa por segundo, em comparação com a necessidade das bandas cromatográficas estreitas de GCxGC, o que limita a sua utilização na técnica.

Como o equipamento GCxGC-qMS é mais robusto, com baixo custo e de fácil operação, muitos estudos foram realizados a fim de melhorar essa hifenação. Um deles é a diminuição da faixa de massa a ser investigada na análise para que a taxa de aquisição do qMS seja aumentada. Isso é possível pois a taxa de aquisição, a faixa de massas investigada e o quadrado da largura da base do pico estão relacionados entre si, portanto estreitar o intervalo de m/z pode permitir a coleta de um número maior de espectros de massa. Além disso, foi desenvolvido um sistema de quadrupolo rápido, que permite o aumento da taxa de aquisição para valores maiores que 50Hz, possibilitando assim uma aplicação do GCxGC-qMS em amostras mais complexas. O qMS de rápida varredura permite análises dentro de uma faixa de massa de 100 a 300 Da, porém, se esse intervalo for ultrapassado, se faz necessário o uso de outros tipos de acoplamento, como o TOFMS.

É válido destacar que os espectros obtidos por GCxGC-qMS são mais “limpos” do que os obtidos por GC-qMS. Isso porque a separação na segunda coluna permite que o analito seja separado de outros interferentes e porque, no sistema GCxGC, há diminuição do ruído.

Aplicações

Indicando sua ampla variedade de aplicações, o sistema GCxGC-qMS foi utilizado em diversos estudos, tais como a aplicação na identificação de compostos voláteis em madeira de pinus em estações ferroviárias, na caracterização de compostos de partículas com diâmetro de 29-58 nm, na análise de fármacos e agrotóxicos em tomates, na caracterização de bio-óleo de lignina da palha de trigo, na identificação de compostos em amostras marinhas, na identificação e quantificação de compostos nitrogenados em diesel e na análise de resíduos de agrotóxicos em amostras de tomates, o qual apresentou bons resultados sob uma grande faixa de massa (50-460 m/z) através da utilização do GCxGC-qMS.

A cromatografia unidimensional é amplamente utilizada, porém dependendo da complexidade da amostra a ser analisada, a capacidade de pico da única coluna pode ser excedida, gerando picos que serão a soma de diferentes analitos coeluentes. Dessa forma, o estudo de Mondello et al. buscou avaliar o poder de resolução da técnica de GCxGC-qMS em análises de agrotóxicos em toranja. Com isso, foi possível detectar a presença de 13,2 ppm de imizalil e 4,3 ppm de demeton-S-metil nas amostras de toranja. Portanto, a utilização da técnica GCxGC acoplada com analisador de massas é a melhor solução para separar e identificar contaminantes alvo em uma amostra que contém diversos interferentes.

No trabalho de Cunha et al., amostras de bio-óleo de palha de cana-de-açúcar foram caracterizadas qualitativa e semi-quantitativamente através da utilização da técnica GCxGC-qMS associada ao uso de índices de retenção com temperatura programada. Através desse estudo foi possível demonstrar o potencial da análise GCxGC aliada a um sistema quadrupolar de escaneamento rápido devido a grande riqueza de informações obtidas: foi possível detectar 161 compostos na fase oleosa (entre eles, fenóis, cetonas e hidrocarbonetos, principalmente), enquanto na fase aquosa alcalina da amostra foram detectados 130 compostos (entre eles cetonas e fenóis, majoritariamente).

QqQMS

Cromatografia a gás bidimensional abrangente (2D – GC) foi relatada pela primeira vez em 1991 . A técnica se baseava no uso de duas colunas capilares (com composições de fase estacionária diferente) dentro de um mesmo forno ou em fornos diferentes. Um dispositivo de transferência, conhecido como modulador, era posto entre as duas colunas, o qual transferia sequencialmente as partes da primeira dimensão (1ª coluna) para a segunda (2ª coluna). A primeira coluna (¹D) geralmente apresentava uma baixa polaridade e conseguia separar compostos de acordo com suas pressões de vapores, já a segunda coluna (²D) possuía uma polaridade mais significativa, que poderia realizar interações como ligações de hidrogênio, dipolo – dipolo, entre outras. Dessa forma, ela conseguiria separar uma classe de compostos diferentes da primeira.

A junção da 2D-GC com a espectrometria de massas surgiu recentemente e é uma das ferramentas mais poderosas para análise de misturas complexas de compostos voláteis. A primeira publicação sobre GC X GC-MS foi em 1999 e foi focada na análise de óleo diesel, usando a espectrometria de massas com um quadrupolo.

Ainda mais recente, em 2008, foi descrito o primeiro trabalho utilizando uma modulação de fluxo GC x GC – QqQMS. Nesse trabalho foi explorado a análise de pesticidas e embora tenham se passado 12 anos desde a primeira publicação, poucos artigos foram publicados usando esta abordagem. O motivo a isso se deve ao fato da importância da etapa de análise do massas (MS) ser muito maior que a do GC, dentro do contexto analítico e dessa forma não ser muito comum esse tipo de arranjo. Além disso a instrumentação da cromatografia a gás abrangente bidimensional junto ao triplo quadrupolo permite um arranjo instrumental de 4 dimensões, isso faz com que os cromatogramas gerados sejam complexos e contenham uma alta quantidade de informação. Isso gera o questionamento: é conveniente usar um equipamento com essa complexidade? Um GC-MS não seria suficiente?

A alta sensibilidade e seletividade do triplo quadrupolo já viabiliza analises de inúmeras amostras em diferentes concentrações e matrizes, entretanto, existem algumas situações onde isso ainda não seja suficiente. Amostras complexas e altamente contaminadas normalmente passam por um preparo de amostra antes de serem injetadas no equipamento, uma das etapas analíticas mais laboriosa e com a maior introdução de erros ao método. Atualmente, existem métodos usando GCxGC-MSMS que não aplicam um preparo de amostra. Franchina e colaboradores desenvolveram um método utilizando a GCxGC-MSMS para análise de enxofre em oléo de petróleo. Antes da injeção no equipamento, a amostra era apenas diluída em diclorometano. Isso dá ainda mais importância ao arranjo visto que são métodos diretos e mais sustentáveis.

Para um bom entendimento desse acoplamento, vale a pena descrever também sobre o triplo quadrupolo e seu funcionamento.

Descrição e funcionamento do Espectrômetro de Massas

O espectrômetro de massas possui em seu arranjo uma fonte de íons, um analisador de massas e um detector. A fonte de íons é responsável pela ionização dos analitos, o analisador de massas é a parte do instrumento no qual, ocorre a separação dos íons, baseados nos valores de massa/carga(m/z) e o detector é onde ocorre a captação dos sinais eletrônicos produzidos pelo analíto. O triplo quadrupolo é um analisador de massas e como sugere o nome, ele é composto por três quadrupolos. Cada quadrupolo é constituído por dois pares de cilindros metálicos um par paralelo ao outro sobre os quais são aplicadas uma radiofrequência (RF) e uma corrente direta (DC).A corrente direta  com potencial (U) é aplicado a um par de cilindros do quadrupolo, enquanto o outro par fica ligado a uma radiofrequência alternada. Esse sistema consegue gerar um campo elétrico, o qual é responsável por levar os Íons do quadrupolo ao detector. Uma vez que os íons estão no quadrupolo, a forma de operação do analisador de massas vai depender do objetivo do analista.

O quadrupolo pode operar no modo SIM - Selected Íon Monitoring (monitoramento do íon selecionado) ou SCAN (varredura de massas). O modo SIM opera deixando as voltagens do quadrupolo constantes e o analisador atuará como um filtro de massas, levando ao detector apenas as massas selecionadas. O modo SCAN, opera para uma faixa de massas, onde será feito uma varredura dentro do intervalo de massas selecionada e gerará um cromatograma de íons totais (TIC) que mostrará a incidência das m/z dentro do intervalo de massas selecionado.

O espectrômetro de massas só consegue realizar a separação de moléculas ionizadas, sejam elas positivas ou negativas, por isso sempre será expresso o valor da razão massa/carga dos analitos, que nada mais é que o fragmento ou a molécula ionizada. Para entender melhor como o filtro de massas funciona, pode-se explicar o seu funcionamento através de um exemplo.  Imagine que em uma análise, você selecione o modo SIM de trabalho e objetive um íon molecular com um m/z de 250.  Todas as massas/cargas que foram ionizadas entrarão no quadrupolo e serão forçadas a passar através dele. Moléculas que estiverem ionizadas com cargas positivas unitárias terão as mesmas forças de atração e repulsão eletrostática, porém, quando aplicado um campo elétrico de polaridade negativa nos cilindros, os íons alterarão sua trajetória em direção aos cilindros até o momento em que ocorra novamente a mudança do campo elétrico para uma polaridade positiva. Neste momento, moléculas com m/z diferentes de 250 não conseguem desviar sua trajetória e colidem com os cilindros, enquanto que moléculas com m/z próximo de 250, conseguem repelir o cilindro e voltar ao centro. Isso continua acontecendo até os íons chegarem ao detector.

Entendendo como um quadrupolo funciona, fica mais fácil de entender como o triplo quadrupolo (QqQ) funciona e o porquê é mais seletivo. O QqQ é composto por três quadrupolos, o primeiro (Q ou Q1) tem a função de um filtro de massas e pode ser utilizado tanto no modo SIM como no modo SCAN.  O segundo (q ou Q2) recebe os íons precursores de Q1 e pode atuar de duas formas: inativa, apenas conduzindo os íons ao Q3, ou poderá ainda atuar como uma célula de colisão, fazendo a fragmentação dos íons precursores. Essa fragmentação ocorre devido ao choque das moléculas do analito com um gás de alta energia. Por fim, o terceiro quadrupolo (Q ou Q3) poderá atuar também como um filtro de massas no modo SIM, buscando algum fragmento gerado em Q1 ou no modo SCAN, ou analisando os fragmentos gerados em q .

A figura acima exibe uma das formas de se trabalhar com QqQMS. A fonte de íons, passa os fragmentos e moléculas ionizadas para o primeiro quadrupolo. Nesse exemplo Q1 atua como um filtro de massas e muitos íons colidem com as hastes do quadrupolo. Os íons que passam por Q1, vão a Q2 (q) e sofrem uma nova fragmentação para em seguida, em Q3, serem selecionados apenas os íons-produto de interesse do analista.

Tipos de varredura

As combinações das formas de uso de cada quadrupolo permitem diferentes tipos de varredura, os quais possibilitam obter diferentes informações sobre a molécula de interesse.

1)     Monitoramento de reação selecionada- Selected Reaction Mode (SRM)

O monitoramento de reação selecionada utiliza (Q1) para selecionar um íon de m/z pré-definido (íon precursor), em seguida, em (q) ocorre a fragmentação do mesmo através da colisão com um gás de alta energia. Em (Q3), serão selecionados apenas um ou alguns fragmentos gerados do íon precursor. Essa é uma das técnicas mais utilizadas em análises quantitativas pois é extremamente seletiva e tem uma melhoria significativa na relação sinal/ruído. A figura 2 é um exemplo desse tipo de monitoramento.

2)     Varredura de Íon-Produto

A varredura de Íon-Produto trabalha com (Q1) no modo SIM, isolando um íon precursor, seguindo de sua fragmentação em (q). Em Q3, opera-se no modo SCAN produzindo um espectro de massas com os íons produtos. Esse tipo de análise gera dados sobre o padrão de fragmentação do composto e é muito utilizado para análises qualitativas.

3)     Varredura de Íon-Precursor

A varredura de Íon precursor realizará uma varredura de íons em um intervalo definido pelo operador (SCAN) em (Q1). Em (q) ocorrerá a colisão/fragmentação das moléculas e em Q3  transmitirá apenas os íons produtos definidos pelo operador (SIM). Essa função tem uma aplicação qualitativa muito importante, pois a partir dela consegue-se determinar características das moléculas, como por exemplo, as funções orgânicas (fenil, propil, benzil, entre outros). Por exemplo, se o Q3 estiver ajustado para determinar m/z 77 ([C₆H₅]⁺), a varredura de íons mostrará todos os compostos que apresentam o grupo fenil.

4)     Varredura de Perda-Neutra

A varredura de perda neutra é utilizada para detectar a perda de fragmentos neutros, como H₂O, CO₂, NO₂. Para tanto, opera-se tanto Q1 como Q3 no modo de varredura de íons (SCAN), mas com uma diferença de m/z. Por exemplo, a perda de uma molécula de água; se em Q1 a molécula apresentar m/z 220, em Q3 ela apresentará uma m/z 202.

Aplicações GCxGC-MSMS

As aplicações da GCxGC-MSMS citadas na literatura são voltadas para amostras com um alto grau de complexidade. Franchina trabalhou com esse arranjo junto a um modulador de fluxo para determinar enxofre em amostras de petróleo. Segundo a autora, a complexidade da amostra justifica o uso dos dois sistemas bidimensionais: a 2D GC junto ao QqQMS. Ela destaca também a importância desse sistema, por não precisar de preparos de amostra intensivos, como o pré-fracionamento da amostra (antes da injeção no equipamento).

O fato de se poder trabalhar com compostos alvos (pré-determinados) e classes de compostos, dentro da mesma análise, torna ainda mais interessante o uso dessa ferramenta. Hashimoto e colaboradores usaram o arranjo GCxGC-MSMS para análise de poluentes orgânicos em amostras ambientais e biológicas. Nesse trabalho, o grupo buscou a detecção seletiva da alguns compostos e a detecção global de organohalogêneos através da varredura de perda neutra de cloro, bromo e flúor. Foram analisados três tipos amostras: cinzas particuladas, sedimentos e solos.

Além disso, Hashimoto encontrou uma resolução cromatográfica muito melhor com esse arranjo do que na GC – MSMS convencional.

Conforme a imagem mostra, o pico “a” expresso pela técnica convencional GC - MSMS, na verdade eram três picos coeluídos “b”,”c” e “d”. Isso mostra que a técnica apresentou uma performance superior na seletividade e detecção de compostos organohalogenados.

Uma outra aplicação interessante do GCxGC-MSMS é para análises de inseticidas em especiarias. Poliak desenvolveu um método específico para análise de Diazinon em coentro. Nesse método ele pode ver o quão eficiente foi o uso GCxGC – MSMS, em comparação a GC – MS e GCxGC-MS.

É importante destacar, que nesse trabalho, Poliak fez o uso da ionização através de um feixe molecular supersônico, por isso ele descreve o arranjo como GCxGC-SMB – MSMS. Isso nada mais é que a cromatografia bidimensional acoplada ao triplo quadrupolo, com uma ionização pelo  feixe molecular supersônico (ou do inglês supersonic molecular beams - SMB)

A figura apresenta três cromatogramas. O primeiro, na parte de cima, mostra uma varredura completa pelo GC-SMB-MS (cromatografia unidimensional acoplada a um quadrupolo com ionização feixe molecular supersônico) próximo ao tempo de eluição da diazinon e o espectro de massa obtido do mesmo. Como se pode ver, a imagem está congestionada e o pico pouco definido. Isso impede que o espectro de massas possa ser comparado com a biblioteca do software. A biblioteca do software contém o espectro de massas de massas puro de muitos compostos, isso permite que o analista consiga comparar o espectro de massas obtido com o da literatura, para verificar se o pico é de fato, do composto investigado. Essa biblioteca é provida pela NIST (Nacional Institute of Standarts and Technology)

 No segundo cromatograma, utiliza-se o arranjo GCxGC-SMB-MS (cromatografia bidimensional acoplada a um quadrupolo com ionização por feixe molecular supersônico) e o pico destacado pela seta, é o alvo da análise. Quando se tira um espectro de massas do pico sinalizado, alcança-se uma porcentagem de 93,7% de probabilidade de identificação. Isso acontece pois ainda há substancias coeluindo com o diazinon, substâncias que podem surgir da matriz.

No último cromatograma, aparecem quatro picos separados completamente com uma resolução cromatográfica eficiente. O pico com maior área, representa o analito de interesse. Ele é obtido através do “Monitoramento de Reação Selecionado”, que filtra um íon precursor em Q1, fragmenta o mesmo em q e filtra novamente em Q3 um íon produto, fruto da fragmentação do íon precursor. Esse arranjo GCxGC–SMB-MSMS elimina totalmente o efeito da matriz e garante uma detecção e quantificação seletiva.  

Dentro dos usos do QqQ existem limitações e desvantagens também. Quando se opera o equipamento no modo de varredura de íons (SCAN), o equipamento apresenta baixa sensibilidade, o que limita o uso para a análises mais simples. Além disso, os íons produtos não podem ser adicionalmente fragmentados, o que impede o estudo de múltiplas fragmentações para uma melhor elucidação da estrutura da molécula. Quadrupolos são limitados do ponto de vista quantitativo, visto que apresentam baixa exatidão de massas (tipicamente massas medidas com Quadrupolos apresentam exatidão de uma casa decimal) e baixa resolução (resolução unitária). Então na hora de se escolher o equipamento para análise, é necessário entender qual a necessidade.

QqTOF (Alta Resolução)

Ao acoplar um espectrômetro de massas do tipo QTOF no cromatógrafo é possível ter seletividade maior como também reduzir as chances de se obter resultados falso positivos nas análises.

O analisador de massas consegue medir a razão massa-carga dos íons (m/z) e através dessa informação é possível fazer a separação desses íons. Os valores de m/z no caso de íons multiplamente carregados são representados por frações das massas reais desses íons.

Para que isso se torne possível a medir m/z é preciso primeiramente ionizar a molécula em análise para que ela possa ser repelida ou atraída através dos campos magnéticos. A técnica mais conhecida é a ionização de elétrons (EI), onde amostra passa através de uma fonte de ionização no equipamento, que é aquecida e está sob vácuo, fazendo com que as moléculas sejam ionizadas ou vaporizadas. A ionização é realizada através de um feixe de elétrons que passa pela molécula e por ter um alto grau energético (70 eV) esses elétrons conseguem causar uma excitação nas moléculas neutras e o resultado normalmente é a perda de um elétron (ionização).

Para se obter melhores resultados, o uso de mais de um analisador torna-se mais viável, como no caso do triplo-quadrupolo, e análogo a ele existem também o QqTOF (quadrupole time-of-flight, ou quadrupolo tempo de voo), onde o terceiro quadrupolo é removido e substituído pelo TOF.

Após a ionização, os analitos passam pelos quadrupolos. Os analisadores quadrupolos possuem quatro eletrodos que formam campos elétricos oscilantes e esses campos conseguem desestabilizar ou estabilizar os íons quando eles passam pelo quadrupolo, essa separação ocorre de acordo com a m/z dos íons, fazendo com que eles passem pelo detector em momentos distintos, podendo ser caracterizados, nesse primeiro quadrupolo é selecionado um íon precursor (é a partir dele que ocorrerá a formação dos demais íons).

Na próxima etapa é fornecida energia em torno de 20 a 200 eV para os íons antes deles passarem para o segundo quadruplo. No Q2 irá ocorrer uma dissociação induzida por colisão (CID) onde os íons são bombardeados por íons de um gás inerte, costuma-se usar argônio ou nitrogênio, e dessa forma são obtidos os fragmentos do íon precursor.

Após a fragmentação, os íons são passam pelo analisador TOF. A utilização de um analisador TOF de alta resolução faz com que o método se torne mais preciso, pois os espectros emitidos possuem alta precisão de massa e alta resolução, tornando-se um excelente aliado a cromatografia a gás.

No analisador TOF os íons passam por um túnel de voo com comprimento variando de 1 a 2 metros e sem campo magnético, nesse túnel ocorre a separação os íons que possuem energia cinéticas iguais, porém a razão m/z são diferentes. Quando o analisador TOF é utilizado juntamente com o analisador quadrupolo (Q), por meio de um acelerador de íons, os íons são conduzidos de maneira ortogonal do quadrupolo para o tempo de voo.

No TOF é medido qual o tempo que íons com as mesmas energias cinéticas levam para percorrer uma determinada distância. Com essa informação é possível se obter os valores de m/z e consequentemente ter a formação do espectro.

Em resumo, o espectrômetro de massas QqTOF irá funcionar da seguinte forma: a molécula a ser analisada é ionizada, passa por um filtro (Q1) e é fragmentada (Q2) e em seguida os íons selecionados de acordo a razão massa-carga (m/z) passa pelo analisador de tempo de voo (TOF) onde será produzido o espectro de massa.

Ficheiro:Esquematização do QqTOF.jpg

Esquematização do QqTOF

Aplicações

Em uma análise de compostos aromáticos em laranja-de-umbigo, cerca de 98,30% de compostos voláteis foram identificados utilizando a técnica GCxGC, na técnica 1DGC, foi possível identificar cerca de 45% de compostos voláteis. Os picos que apareceram coeluídos na 1DGC apareceram bem resolvidos na GCxGC e através do QTOF foi possível identificar quais eram cada um desses compostos, a razão m/z da faixa de varredura utilizada foi de 50 a 500.

Uma outra aplicação utilizando a técnica GCxGC-QTOF foram em análises de amostras de madeira ágar de quatro países, sendo essas amostras de oito regiões diferentes, com o objetivo de identificar os componentes dessas amostras. Para isso foram produzidos extratos de metanol dessas amostras. O uso do QTOF permitiu a identificação de 223 espécies constituintes provindos de seis diferentes tipos de grupos químicos e com isso foi capaz de verificar que madeira ágar sofre algumas alterações em sua composição dependendo da região em que ela é extraída, nesse estudo a razão m/z da faixa de varredura utilizada também foi de 50 a 500.

TOF (baixa resolução)

Imagem detalhada de um aparelho GCxGC-TOFMS com todos os componentes do sistema .

A cromatografia gasosa bidimensional (GCxGC) foi desenvolvida para atender à uma crescente demanda por análises de amostras complexas e para lidar com limitações, como capacidade de pico, faixa dinâmica e especificidade restrita de sistemas GC unidimensionais (1D-GC). Na verdade, a adição de uma segunda dimensão cromatográfica com uma fase estacionária complementar pode aumentar a separação e o poder de resolução de GCxGC sobre 1D-GC em, aproximadamente, 10 vezes.

A GCxGC-TOFMS possui recursos de separação superiores realizados em duas fases estacionárias diferentes, alta seletividade e resolução aprimorada o que facilita a identificação e quantificação aprimoradas de analitos em nível de traço, sendo assim uma alternativa para análise de matrizes complexas, como voláteis de alimentos e bebidas.

TOFs são compostos basicamente de tubos metálicos sob vácuo e isolados do campo externo. Inicialmente, íons são acelerados em direção ao detector por meio de um potencial repulsivo aplicado em um dispositivo localizado no início do TOF. O tempo necessário para o íon chegar ao detector é proporcional à raiz quadrada da razão m/z, ou seja, quanto maior o íon, mais tempo ele leva para percorrer o comprimento do tubo.

O analisador de massa TOF requer aparatos eletrônicos que sejam rápidos o suficiente para medir os tempos de voo de íons, que podem ser menores do que microssegundos. Além disso, os íons em um sistema TOF devem ser criados em pulsos breves e bem definidos, para que todos os íons iniciem suas trajetórias na direção do detector ao mesmo tempo.

A ausência de distorção de concentração no instrumento TOFMS garante a continuidade espectral e permite a deconvolução (capacidade de resolver picos parcialmente sobrepostos explorando diferenças espectrais de massa) de picos cromatográficos coeluentes caracterizados por diferentes padrões de fragmentação.

O uso de corrente de íon deconvoluída (DIC) torna o TOFMS quase como uma terceira dimensão para o sistema de separação. Logo, o acoplamento GCxGC-TOFMS é um instrumento poderoso que combina a resolução cromatográfica aprimorada do GCxGC e o poder de resolução analítico do TOFMS.

Um fator importante a ser considerado na espectrometria de massa é a resolução, que pode ser definida de acordo com a relação da resolução com a massa da partícula e com a diferença de massa entre uma partícula de massa M e a partícula com a segunda massa mais alta que possa ser resolvida pelo instrumento.

$R={\frac {M}{\Delta M}}$

A resolução de massa do instrumento TOF é proporcional ao tempo de voo do íon. Portanto, usar um tubo maior aumenta a resolução. Com tubos menores, é possível uma resolução de apenas 200 – 500.

Os analisadores TOF de baixa resolução (LR TOFMS) são caracterizados pela resolução de massa unitária e por recursos de geração espectral muito alta (por exemplo, 500 Hz). Realizam a separação de íons explorando as diferenças nas velocidades com que os íons passam pelo “tubo de voo”. No sistema LR TOFMS, a sensibilidade é maior quando comparado com um instrumento QMS. Por tal motivo, quando os analitos alvo cobrem uma ampla faixa de massa e deseja-se a identificação de compostos desconhecidos, o uso de um instrumento TOFMS torna-se necessário.

Aplicações GCxGC-LR TOFMS

• Logo após a morte, o processo de decomposição dos tecidos moles de mamíferos começa e leva à liberação de compostos voláteis cadavéricos no ambiente ao redor. Esses compostos cadavéricos, principalmente compostos orgânicos voláteis (VOCs), são subprodutos ou produtos finais do processo de decomposição. Os VOCs de cadáveres encontram aplicações nas ciências forenses e na etiologia da morte, no treinamento de cães cadáveres para detecção de restos humanos, no desenvolvimento de dispositivos de detecção de material cadavérico (sensores eletroquímicos), na exploração do olfato de insetos (biossensor ou biodetector) ou na determinação do intervalo post-mortem (PMI). A complexidade das amostras pós-morte voláteis requer o uso de métodos analíticos mais complexos. Por exemplo, o GC unidimensional não consegue detectar quantitativamente os ácidos de cadeia curta e longa devido à diferença de polaridade nas moléculas. Nesse caso, GCxGC-LR TOFMS, pode ser usado para analisar as amostras complexas de VOCs.

• Biomarcadores são compostos usados ​​em estudos paleobiológicos ​​para efetuar a correlação óleo-óleo e óleo-fonte, bem como para avaliar a extensão da biodegradação do petróleo bruto. Considerando a importância desses compostos nas análises geoquímicas, é extremamente importante avaliá-los com precisão. O uso da GC-MS ocasiona a perda de muitas informações pois, devido à presença de uma infinidade de picos e efeito de coeluição, muitos compostos passam despercebidos na análise. A GCxGC-LR TOFMS torna-se uma opção ideal para caracterizar biomarcadores presentes em misturas complexas como petróleo bruto e extratos de sedimentos orgânicos. Com a aplicação da GCxGC-LR TOFMS, é possível identificar as impressões digitais químicas de petróleo bruto e também caracterizar uma mistura complexa não resolvida (UCM) em óleo biodegradado de reservatório e amostras de derramamento de óleo. Portanto, a caracterização detalhada de biomarcadores usando a técnica GCxGC-LR TOFMS abre um novo caminho para a pesquisa em estudos paleobiológicos e na exploração de hidrocarbonetos.

Orbitrap

Antes de discutir o acoplamento da cromatografia a gás bidimensional abrangente (GCxGC) com espectrômetros de massas de alta resolução da “geração Orbitrap”, é importante entender como essa nova família de espectrômetros surgiu e se desenvolveu. Tudo começou em 1923 com um trabalho teórico de K.H. Kingdon , que descrevia a possibilidade de aprisionar íons em uma armadilha tubular contendo um eletrodo central, ao redor do qual os íons orbitariam. Na época ainda não havia tecnologia para manipular os íons, tampouco havia a intenção de utilizar tal arranjo para medir a massa dos íons.

Ao longo das décadas seguintes a instrumentação para controle dos íons foi se desenvolvendo a medida que outros analisadores de massas surgiram, como  o Analisador por Setor Magnético, Quadrupolo, Ion Trap, e o analisador por Tempo de Voo . Em 1981, R.D. Knight conseguiu utilizar uma armadilha orbital para a determinação da massa de íons gerados por laser in situ, ejetando-os da armadilha para um detector. O aparelho era construído com duas cascas cônicas isoladas entre si, que envolviam um eletrodo central em formato de fio. Todo o sistema era mantido evacuado (1,3.10^-10 atm, ou 10^-8 torr). Nas cascas aplicava-se uma tensão variável com frequência compatível com os íons gerados (tensão RF), que orbitavam o fio central em um movimento de espiral, que oscilava de uma casca a outra ao redor do eletrodo central. A frequência de oscilação era proporcional a razão da massa/carga dos íons (m/z). A detecção ocorria pela aplicação de uma tensão positiva no eletrodo central, ejetando os íons na direção deste eletrodo e para fora das cascas cônicas, onde havia uma fotomultiplicadora de elétrons que registrava um aumento de corrente elétrica em função da quantidade de íons ejetados. O instrumento não permitia a detecção simultânea de várias espécies de íons, nem mesmo de misturas simples, mas já demonstrava o potencial da técnica para a espectrometria de massas .

Foi em 1999 que Alexander Makarov, em parceria com a empresa HD Technologies – posteriormente adquirida pela Thermo Fisher Scientific, apresentou a patente do primeiro espectrômetro de massas da família Orbitrap. O fio metálico central do experimento de Kingdon foi substituído por um eletrodo metálico maciço com formato de fuso, e as cascas cônicas  do experimento de Knight foram substituídas por eletrodos cilíndricos com cavidade elíptica, confeccionados em aço inox empregando usinagem de alta precisão .

Da mesma forma que ocorria no experimento de Knight, os íons injetados no Orbitrap descrevem um movimento complexo em forma de espiral ao redor do fuso, oscilando entre os polos da armadilha. De forma simplificada, essa frequência de oscilação é proporcional a razão m/z dos íons (m/z ^-1/2). Os eletrodos externos que compõem a cavidade são utilizados como detectores, uma vez que a oscilação dos íons ao redor do fuso central induz pequenas correntes que são amplificadas, e geram um registro preciso e de alta resolução do sinal em função do tempo, denominado “transiente”. Todo o processo leva algumas dezenas ou centenas de milésimos de segundo, e após o final do ciclo de registro de íons, uma nova carga de íons começa a ser analisada no Orbitrap. Utilizando transformada de Fourier, o transiente é transformado do domínio do tempo para o domínio da frequência (o eixo ‘x’ passa a representar a frequência), e o gráfico resultante já se assemelha a um espectro de massas. Como a relação entre frequência e m/z é conhecida através do desenvolvimento das equações do campo magnético quadro-logarítmico no interior da armadilha, finalmente o espectro de massas é obtido pela conversão de cada valor de frequência no eixo x no respectivo valor de m/z.  

Sequencia de eventos para obtenção do espectro de massas no espectrômetro Orbitrap: A) injeção dos íons no Orbitrap; B) inicio da rampa de tensão no eletrodo de fuso e coleta de sinal nos eletrodos coaxiais; C) cada grupo de íons com mesma m/z oscila ao longo do eletrodo de fuso de forma semelhante à oscilação de um pendulo, obtenção do "transiente" com informação no domínio do tempo; D) transformada de Fourier para obtenção de informação no domínio da frequência, conversão de frequência em valor de m/z, inicio de um novo ciclo de injeção no Orbitrap.

Dois parâmetros importantes em espectrometria de massas são o “poder de resolução” e a exatidão. O poder de resolução é o quociente entre a massa de um íon qualquer e a largura do sinal do mesmo íon. Uma forma de compreender o que o poder de resolução significa seria compara-lo com a escala de uma régua: tomando m/z=200 como exemplo, num GC comum com resolução unitária a régua de m/z teria a escala em metros, num TOF de alta resolução operando a 60 000 de resolução a escala seria de 3,3 mm, num Orbitrap “comum” operando a 120 000 de resolução a escala seria de 1,6 mm, e num Orbitrap experimental da Thermo Fisher Scientific, com tempo de transiente ampliado e operando a 2 000 000 de resolução, a escala seria de 100 µm.

A exatidão em analisadores Orbitrap pode atingir valores bastante elevados, atribuindo portanto “confiança” ao alto poder de resolução. Por exemplo, um Orbitrap Q Exactive GC, operando com padronização interna e com a função “lock masses” ativa, apresenta erros de m/z da ordem de sub-ppm (menores que uma parte em um milhão). Para uma m/z = 200,0152, por exemplo, o erro estaria na quarta casa decimal.

“Mas para quê tanta precisão em uma régua?” Supondo uma situação hipotética na qual pessoas foram intoxicadas tomando suco de laranja, e a análise por LC-MS mostra um íon candidato a contaminante com m/z = 230. Mesmo com a análise da fragmentação do íon m/z = 230, seria difícil determinar que substância contaminou o suco: uma busca no Chemspider (chemspider.com) apresenta 460 mil substâncias com m/z = 229. Repetindo a análise em um sistema Orbitrap Q-Exactive a 120 mil de resolução o íon do contaminante apresentaria m/z = 230,2659 que poderia ser atribuído ao pesticida organofosforado Dimetoato.  Alto poder de resolução, portanto, é importante para a identificação de compostos desconhecidos.

A hifenação de GCxGC com Orbitrap poderia fornecer resultados impressionantes, aliando a alta capacidade de pico da GCxGC com alto poder de resolução e exatidão do Orbitrap. Uma busca na literatura, no entanto, mostra pouquíssimos trabalhos explorando essa possibilidade. Uma possível explicação para esta ausência de trabalhos seria que o alto poder de resolução do Orbitrap não permite uma taxa de aquisição de sinal compatível com a GCxGC. A tabela mostra a variação da velocidade de varredura em função do amento da resolução em um Orbitrap Q-Exactive GC.

Espectros por Segundo	Resolução
18	15 000
12	30 000
7	60 000
3	120 000

Operando com resolução de 30 000, por exemplo, o Q-Exactive GC produz 12 espectros por segundo. Por outro lado, espectrômetros TOF operando em resolução semelhante podem produzir até 200 espectros por segundo. Considerando que a GCxGC opera com tempos de modulação da ordem de 2 a 8 segundos e produzindo picos com 50 a 600 milissegundos de largura, espectrômetros Orbitrap em alta resolução podem não produzir pontos suficientes para a correta reconstrução do pico na segunda dimensão.

Aplicações

Em um trabalho recentemente publicado no Journal of Mass Spectrometry, N. Hung e colaboradores estudaram a aplicabilidade da técnica GCxGC-Orbitrap para análise de óleo de pirólise de celulose. A escolha da matriz de elevada complexidade química é justificada pelo crescente apelo por fontes renováveis de energia e de insumos químicos, e a queima de biomassa pode oferecer ambos.

Os autores empregaram uma coluna polar FFAP 50 m x 0,25 mm x 0,25 µm na 1D, e uma coluna apolar SLB5 2 m x 0,10 mm x 0,10 µm na 2D. Um modulador criogênico de duplo estágio modelo ZX2 da Zoex foi empregado, com tempos de modulação de 5 a 9 segundos. O gás de arraste empregado foi He a 1,5 mL min^-1, em uma rampa de aquecimento iniciando em 55°C por 2 min, 5 °C/min  até 240 °C, permanecendo por 5 minutos em 240 °C.

Primeiro os autores avaliaram a alteração de vários parâmetros operacionais, como energia de ionização, faixa de varredura, resolução e quantidade de íons acumulados para a identificação de uma solução padrão de naftaleno. Foi observado que operando a 15 000 de resolução foi possível obter 25 espectros por segundo, o que possibilitou a reconstrução dos picos na 2D com pelo menos 7 pontos.

Mantendo a resolução em 15 000 foram realizados dois estudos: o primeiro de identificação de um mix de 23 compostos através da biblioteca do software do equipamento, e um segundo estudo quantitativo de alfa-pineno empregando canfora como padrão interno. No primeiro estudo a metade das substâncias foi corretamente identificada, apresentando bons valores de similaridade. No segundo estudo foi obtida uma boa correlação entre sinal e concentração, abrangendo linear de 10 a 1000 ppm.

Os autores apresentam também uma avaliação do resultado para a amostra real de óleo pirolisado, e indicaram que a identificação dos componentes pela busca na biblioteca foi favorecida pela exatidão na obtenção das massas dos íons. Portanto, mesmo operando a resoluções mais baixas, o Orbitrap favorece o resultado pelo ganho de exatidão.

Equipamentos comerciais

Atualmente três grandes empresas vêm competindo pelo mercado GC×GC: Zoex, LECO e Shimadzu. A Zoex e LECO são as principais fornecedoras para os equipamentos GC×GC-TOFMS, fornecendo também software para a leitura e interpretação de dados. Porém o software da LECO, ChromaTOF, tem seu uso restrito aos equipamentos da própria empresa, modelos Pegasus 4D. Já o software da Zoex, GCImage, é compatível com todas plataformas de dados abrangendo de GC×GC-FID até GC×GC-MS (tanto analisadores quadrupolares e por tempo de voo) das mais diversas fabricantes. E mais recentemente a Shidmazu lançou seus equipamentos GC×GC-qMS, devido a maior velocidade de varredura de seus novos analisadores quadrupolares (até 20.000 Th por segundo).

Aplicações

Metabolômica

A metabolômica é o estudo que visa identificar, caracterizar e quantificar o conjunto de todos os metabólitos – o metaboloma – produzidos e/ou modificados por um organismo. Devido à excelente capacidade de separação para misturas complexas de produtos químicas, a cromatografia gasosa bidimensional abrangente (GCxGC) está sendo utilizada com crescente frequência para análises metabolômicas. A seguir, algumas aplicações recentes foram selecionadas para demonstrar como os estudos de metabolômica com GCxGC podem facilitar descobertas e impulsionar a ciência em diversas frentes.

As bactérias produzem metabólitos voláteis característicos e isso pode ser utilizado para uma gama de aplicações na medicina, ciência e indústria. Uma possível aplicação é para diagnosticar infecções de bactérias patogênicas in situ, ou seja, direto de uma ferida, de uma amostra de urina ou da respiração, sem ser necessário recuperar os micróbios ou seu material genético – isso reduziria as chances de um falso-negativo, além de proporcionar um diagnóstico mais rápido. O método de cromatografia gasosa–espectrometria de massa (GC-MS) foi utilizado por décadas para a identificação não-direcionada de metabólitos voláteis de culturas bacterianas. O trabalho pioneiro na aplicação do método de GCxGC para este propósito analisou os metabólitos voláteis da bactéria Pseudomonas aeruginosastrain PA14, uma bactéria já muito bem estudada pelo método anteriormente utilizado (GC-MS) e demonstrou o ganho de informações quando utilizado do GCxGC (no trabalho, utilizaram GCxGC-TOFMS), que, com o novo método, praticamente dobrou os metabólitos voláteis identificados.

O ar exalado na respiração tem grande potencial para diagnóstico e monitoramento médico, sendo que os biomarcadores detectáveis na respiração através de GCxGC podem ter sido produzidos pelo patógeno, pelo hospedeiro ou por alguma interação entre eles. O Food and Drug Administration (FDA), inclusive, possui uma série de diagnósticos por respiração aprovados, como: teste de monóxido de carbono para capnografia, teste de monóxido de carbono para icterícia neonatal, testes de hidrogênio e metano para diagnóstico gastrointestinal, teste de óxido nítrico para monitorar terapia para asma, detecção de rejeição de transplante de coração e teste de ¹³C-uréia para infecção por Helicobacter pylori. Outras doenças mostram-se promissoras de que seus diagnósticos possam ser realizados por testes de respiração, como câncer de pulmão, doença pulmonar obstrutiva crônica, infecções associadas à fibrose cística, pneumonia bacteriana e tuberculose. Pela proximidade humana em relação à interface patógeno-hospedeiro, cobaias animais como macacos são essenciais para identificar compostos biomarcadores potenciais e validá-los para uso de diagnósticos em humanos. Como é o caso do estudo de viabilidade feito com macacos cinomolgos (Macaca fascicularis) e macacos rhesus (Macaca mulata) infectados com o patógeno da tuberculose (Mycobacterium tuberculosis). O ar exalado da respiração antes e depois da infecção foi analisado utilizando GCxGC-TOFMS e esse trabalho demonstrou que a amostragem e a análise da respiração são viáveis ​​em cobaias animais e que os metabólitos da respiração podem servir como marcadores úteis de infecção.

A urina é uma rica fonte de metabólitos de todo o corpo e, muitas vezes, é utilizada para exames, como testes antidopings. Desde 1972 a cromatografia gasosa acoplada a espectrometria de massas (GC-MS) vem sendo empregada para identificação de esteróides anabolizantes em testes antidopings com urina. De lá para cá, o método evoluiu consideravelmente, porém a análise de misturas complexas de esteróides extraídos da urina é limitada pela eficiência da separação do método. Em substituição, também é possível utilizar-se de cromatografia gasosa acoplada a espectrometria de massa em tandem (GC-MS/MS), o que aumenta o limite de detecção, porém requer uma análise direcionada. O desenvolvimento do método de cromatografia gasosa bidimensional abrangente (GCxGC) acoplado a TOF-MS ou a qMS para a análise de amostras aumentou consideravelmente a capacidade de separação e detecção.  Recentemente, GCxGC-TOFMS tem sido utilizada para análise de esteróides, porém por ser mais barato e menos poluente, há também vantagens no uso de GCxGC-qMS, além de aspectos de capacidades técnicas, como ionização química positiva (PCI) e negativa (NCI). O método de GCxGc-qMS pode ser utilizado para analisar amostras complexas de esteróides extraídos da urina com alta especificidade e sem direcionamento, sendo que isso pode ser usado tanto para detectar doping em atletas quanto para indivíduos em tratamento de terapêutico com esteróides.

A metabolômica é uma ferramenta importante na compreensão de como um organismo responde a diferentes estímulos externos. Um estudo interessante neste aspecto foi feito com duas espécies de bivalves do mesmo gênero: ameijoa-boa e ameijoa japonesa (Venerupis decussata e Venerupis philippinarum, respectivamente). Estas são as duas espécies de bivalves mais exploradas comercialmente ao redor do mundo, ambas são moluscos comestíveis, com importância econômica e ecológica, que compartilham condições e habitats semelhantes e por isso podem competir em ambientes naturais e em fazendas de aqüicultura. Muito pouco se sabe sobre as diferenças nos metabolismos das duas espécies, assim como também pouco se sabe sobre as variações de metabolismo que acontecem durante seus ciclos de vida devido a mudanças ambientais (temperatura, salinidade, contaminantes, infecções ou parasitas, por exemplo). Por este motivo, o estudo utilizou de GCxGC-TOFMS como método de alta sensibilidade para estabelecer padrões metabólitos específicos para cada espécie, e isso pode ser utilizado como base para discriminar espécies de moluscos próximas e de mudanças nos organismos provocadas por fatores externos. Mesmo vivendo em simpatria, ambas as espécies experimentaram condições diferentes, como ambiente de filtração e diferenças fisiológicas e bioquímicas, e isso refletiu em seu metaboloma volátil. Esse método abre caminho para o uso de bivalves combinados com análise de metabólitos com GCxGC-TOFMS em diferentes áreas, como em marcadores na detecção e identificação de mudanças sutis originárias de condições bióticas e abióticas. Isso também dá base para a expansão desde tipo de análise para outros grupos de seres vivos.

GCxGC também é utilizado no estudo de plantas, identificando e caracterizando seus complexos metabolomas com o intuito de compreender aspectos de suas fisiologias, ecologias e qualidade como matérias-primas e alimentos. Exemplo disso é o estudo do metaboloma de tomates para identificar aspectos da resistência à contaminação por cepas saprofíticas de Alternaria alternata, fungo que freqüentemente gera toxinas no tomate, como alternariol (AOH), éter monometílico de alternariol (AME) ou ácido tenuazônico (TeA). É sabido que AOH é fator para a colonização do fungo no tomate e variedades mutantes do fungo A. alternata que não produzem AOH não são capazes de infectar tomates. Para isso, duas variedades de tomates foram analisadas, uma resistente à infecção do fungo e outra suscetível, utilizando do método de GCxGC-MS e comparando os metabólitos encontrados nas duas variedades, o ácido clorogênico (CGA) foi o metabólito mais discriminante. Para confirmar a influência do CGA, foi analisado sua influência no crescimento, na expressão do gene pks – gene responsável pela biossíntese de AOH e AME – e na biossíntese de AOH e demonstrou-se que o metabólito GCA é responsável por reduzir a biossíntese de AOH pelo fungo, assim impedindo a infecção do tomate.

Além de estudos descritivos nos quais metabólitos são descobertos e identificados, correlacionar esses dados a mecanismos celulares que os produzem ou regulam e a diferentes fenótipos ou interação que facilitam é o próximo passo no estudo da metabolômica. Os dados metabolômicos obtidos do GCxGC podem ser ligados a outras análises, como análises químicas, biológicas, comportamentais e estatísticas, que contextualizem o metaboloma, assim gerando conhecimento ainda mais rico. Um trabalho interessante que faz a análise de compostos decorrentes de interações multitróficas entre diferentes organismos vivos é o estudo da interação entre algumas espécies de hortelã (Mentha sp.) e seu inseto predador (Chrysolina herbacea). As plantas de hortelã produzem metabólitos de defesa a ataques de herbívoros e poucos insetos conseguem ingeri-las, porém, a Chrysolina herbacea possui um relacionamento altamente específico com a hortelã, já que é resistente às suas toxinas (principalmente terpenóides). No trabalho, a Chrysolina herbacea foi alimentada com três espécies diferentes de hortelã e os metabólitos voláteis emitidos tanto das fezes dos insetos quanto das folhas das plantas foram analisados por GCxGC-qMS para que uma correlação pudesse ser criada, para se avaliar a capacidade do inseto de se alimentar de compostos tóxicos (ou seja, discriminar terpenóides transformados pelo processo digestivo dos insetos), para se estudar o papel dos voláteis do excremento do ponto de vista ecológico e para melhor compreensão da ecologia e fitoquímica de interações planta-inseto. Assim, entende-se que para se derivar algum significado de dados metabólicos, uma abordagem multidisciplinar é necessária, podendo contar com colaborações das áreas da química, biologia, medicina, matemática, entre outras.

Análises forenses

O uso da técnica de GCxGC em investigações forenses tem se desenvolvido nos últimos anos, tornando-se uma ferramenta muito popular em laboratório analíticos, onde químicos lidam diariamente com amostras complexas. Com o aumento da razão sinal ruído e capacidade de geração de picos com mais detalhes direciona a uma tendência de uso ao invés da tradicional técnica de GC em uma dimensão . Em ciências forenses podem ser encontradas em trabalhos como análise de drogas de abuso ou ilícitas, toxicologia forense, análise de resíduos de incêndio, como investigação ARSON análise de fósseis, análise ambiental e forense química, biológica, radioativa e nuclear (do inglês CBRN – Chemical, Biological, Radiocative, Nuclear) , cheiro humano , além de outras.

- Contrabando de objetos de animais: A aplicação de GCxGC-TOFMS é um dos métodos para análise de identificação de contrabandos de animais selvagens, como marfim, ossos, amostras de dentina de elefantes. O tráfico ilegal é uma das principais causas para o declínio de espécies na natureza, e os matérias são utilizados com proposta religiosa, para confecção de troféus, potencial nutricional, etc. Por isso uma identificação precisa se faz necessário para as ações judiciais adequadas. Devido a isso é investigado o perfil volatilomico destes materiais . A técnica também é bem estabelecida para detecção de materiais de caça ilegal como chifres de rinocerontes onde é analisado compostos voláteis para distinção das diferentes espécies contrabandeadas. Um método rápido e não invasivo elimina obstáculos de repressão ao tráfico de vida selvagem .

- Incêndios florestais: Incêndios florestais geram uma investigação complexa devido à grande abundância de compostos naturais presentes e subsequentemente dos produtos gerados devido a pirólise durante a combustão. Estes compostos podem estar presentes em grande quantidade e mascarar a identificação dos resíduos de líquidos inflamáveis, trazendo assim resultados ambíguos. O uso de GCxGC é apto a reduzir o número de tentativas de identificação dos resíduos, quando comparado com uma dimensão, certos compostos não são úteis para identificação para líquidos inflamáveis em amostras de incêndio, em particular o grupo dos três mosqueteiros (etilbenzeno, m,p xileno e o-xileno) o qual é onipresente em todas as amostras, por outro lado, a presença de C1 e C2 alquilnaftalenos são excelentes indicadores da presença de gasolina em resíduos líquidos de inflamáveis. Muitos dos incêndios são iniciados propositalmente por Humanos, nos EUA em torno de 86% são causados por atividade humanas e a gasolina é o mais comum líquido inflamável utilizado. . Pesquisas mostram que a utilização de GCxGC-TOFMS permite a detecção de compostos targets com resultados aceitáveis com 100% para hidrocarbonetos de petróleo, 79% de gasolina e 77% de óleo de lâmpadas foram acertadas corretamente em simulação de investigação de incêndios. A presença destes resíduos é indicativo de ARSON em oposição a um incêndio acidental .

- Estudo de lubrificantes sexuais a base de óleo: Lubrificantes comuns utilizados em agressões sexuais são a base de silicone ou a base de água. Estes tipos de lubrificantes são facilmente analisados por diversos instrumentos na ciência forense. Embora estes tipos de lubrificantes sejam misturas de multicomponentes, eles não são tão complexos quanto os lubrificantes a base de óleo ou até mesmo de produtos de higiene pessoal que podem ser usados em agressões sexuais ou encontrada na vítima durante a coleta de resíduos do ato. Lubrificantes a base de óleo são relacionados em um ou mais tipos de óleos, como aloe, girassol, abacate, etc. A utilização de GCxGC melhora a análise pois diminui a co-eluição dos compostos complexos .

- Odores de decomposição Humana: Quando se inicia a decomposição humana, as grandes moléculas do tecido humano se quebram em menores formando os VOCs (Compostos orgânicos voláteis) característicos deste processo biológico. Atualmente é um campo das ciências forenses a identificação destes compostos por meio de cães farejadores no auxílio de grandes desastres, com intuito de encontrar restos de corpos soterrados. A ideia seria ter um equipamento portátil para este trabalho juntamente com o auxílio dos cães farejadores . Os odores gerados pela decomposição formam centenas de compostos voláteis, sendo o processo de decomposição dinâmico dependendo do estágio de decomposição. . Desta forma, tem se tornado parente de que o uso de GCxGC acomplado com espectrometria de massas Time of Flight (TOFMS) e alta resolução TOFMS (HRTOFMS), é válido para análise de compostos orgânicos voláteis (VOCs) de cadáveres em decomposição, assim como o alto numero de VOCs que pode ser detectado e identificado .

- Ambiental Forense: Para análise de hidrocarbonetos de petróleo, cromatografia bidimensional (GCxGC) prevê melhores separações com misturas complexas, aumentando a razão sinal ruído, e direcionando a cromatogramas mais limpos para identificação de compostos desconhecidos. Esta ideia foi significativamente estabelecida nas décadas passadas e se tornou um método bem estabelecido dentro da pesquisa forense em vazamento de óleos, infiltrações naturais e análise de desconhecidos. Petróleo é uma mistura complexa que contém milhares de compostos com funcionalidades químicas diferentes, incluindo alcanos, clicloalcanos, aromáticos, e compostos que contêm enxofre, oxigênio e nitrogênio. Estudos detalhados da origem, destino e transporte de liberação destes compostos no ambiente que exigem uma separação de alta resolução.

- Drogas ilícitas: Safrol, é o principal composto no óleo essencial de várias plantas da família Lauril (laureaceae), e seus produtos secundários piperonilmetilcetona são predominantemente usado como precursor na síntese de drogas ilícitas do 3,4-metilenodioximetanfetamina (MDMA), o qual é, o ingrediente ativo mais comum no tablet de ecstasy. Métodos analíticos com capacidade adequada para identificar a origem do precursor, como o safrol, disponibiliza uma informação valiosa sobre a droga relatada a inteligência policial. Amostras de óleo de sassafraz apreendidos pela polícia foram submetidos a análises comparativa baseada em seus perfis químicos obtidos por cromatografia a gás bidimensional acoplado a espectrometria de massas time of flight (GCxGC-TOFMS). A otimização do poder de separação e aumento da sensibilidade do GCxGC permitiu a detecção de compostos menores presentes no óleo essencial no qual tem interesse particular nos casos de amostras muito puras e no qual perfil de impureza não é muito pronunciado.

- Arqueologia: Microextração em fase sólida e cromatografia a gás e espectrometria de massas é tradicionalmente utilizada em combinação com outras análises para caracterização de resíduos orgânicos oriundos de espécimes arqueológico, recentemente em muitos campos das ciências, GCxGC-TOFMS tem provido inúmeros benefícios quando comparado com GC-Ms. O estudo de material arqueológico é um desafio particular por várias razões, o fator mais pertinente é a quantidade de resíduos orgânicos disponíveis na análise e serem uma quantidade extremamente pequena, outro fator é a idade da espécie arqueológica resultando em alguma ou total degradação do objeto.  Para complicar, o histórico detalhado do ambiente em que a amostra foi exposta é totalmente desconhecida. Muitas das matrizes analisadas possuem complexos de compostos não voláteis, semi-voláteis e voláteis, a presença de picos co-eluidos é uma realidade na utilização de 1 dimensão em uma mistura de complexos não resolvidos (UCM – unresolved complexe mixture), o que é otimizado com a utilização de 2D .

Análise de alimentos

A análise de alimentos é crucial para o controle de qualidade e segurança alimentar desde seu valor nutricional até seu armazenamento para que evite contaminações (Kudlejova, L., Risticevic, S.). A técnica por GCxGC tem grande vantagem frente às outras, devido ao número máximo de compostos que podem ser separados em uma mesma análise (PEDROSO,2009).

Esse método de análise nos permite determinar o sabor de uma alimento por exemplo, como fez Mohamed Adahchour; Jaap Wiewel; Ramon Verdel; René J.J.Vreuls e Udo A.Th.Brinkman com a Manteiga. O teste foi realizado por meio de microextração de fase sólida em dois tipos de manteiga fresca, onde houve o preparo da amostra, o que é necessário em vários tipos de análise para métodos GCxGC, colocando-as em condições adequadas. Na coluna de primeira dimensão usou-se 30m x 0,25 mm ID, 0,25 μm BP21 (polietilenoglicol, tratado com TPA) (SGE Europa) e na de segunda dimensão usou-se BPX-35 de 1  m  ×  0,1  mm, 0,1  μm (SGE Europa) e ambas foram conectadas. houve análise de compostos polares através de fase aquosas da amostra que quando submetidos a dois níveis de temperatura (40° e 170° C) ficou nítida a diferença dos compostos nos cromatogramas quando a temperatura era elevada, sendo analitos polares e compostos polares evidentes com maior intensidade. Várias classes de compostos desconhecidos foram detectados. Separação aprimorada, fornecimento de informações, problema de resolução, limites de detecção, tempo de retenção (primeira e segunda), logo  todos esses aspectos e alguns outros específicos da amostra e da análise mostraram-se eficientes e melhores identificados pela técnica GCxGC. 

A análise de Gordura e Óleo também foi aplicada a técnica GCxGC em uma trabalho de análise de óleo de peixe. “Os óleos vegetais contêm principalmente a série ω-6 de ácidos graxos, enquanto os óleos de peixe contêm principalmente a série ω-3 de ácidos graxos” (Henk-Jan de Geus, et Al.). A complexidade das cadeias de ácidos graxos nos faz optarmos por análise que tenham uma capacidade melhor de identificação. No trabalho em questão foram usadas amostras de azeite comercial e óleo de girassol. “As amostras de óleo de peixe foram óleo de fígado de bacalhau comercial (Möller tran, Noruega) e óleo de arenque que foi processado a partir de subprodutos de maatjes de arenque” (Henk-Jan de Geus, et Al.). No preparo da amostra ácidos graxos foram convertidos em ésteres metílicos, como discutido anteriormente a amostra para análise precisou de um preparo para que pudesse ser trabalhada em equipamento. No sistema GCxGC, percebeu-se condições totalmente diferentes de outro tipo de análise; neste trabalho os responsáveis usaram:

“Uma coluna de sílica fundida de 9,0 m × 0,2 mm, 0,33 μm HP-1 (dimetilpolisiloxano) (Hewlett-Packard), foi conectada ao injetor split-splitless e, na outra extremidade, ao tubo modulador (8,2 cm × 0,1 mm de sílica fundida revestida com 3,5μm de dimetilpolissiloxano; Quadrex, New Haven, CT, EUA) usando um ajuste de pressão em miniatura (Zoex). Usando dois ajustes de pressão em miniatura e um capilar não revestido de 0,11 m × 0,1 mm, a extremidade do tubo modulador foi conectada à segunda coluna [0,30 m × 0,1 mm ID, 0,2 μm CP-WAX-52 (polietilenoglicol) (Chrompack, Middelburg ,Holanda)], que foi instalado na segunda câmara do forno. Esta segunda câmara do forno foi isolada do primeiro forno por uma parede de cerâmica e pode ser programada em temperatura a partir do painel de controle do GC”. (Henk-Jan de Geus, et Al.)

Dentre os resultados obtidos notou-se que o uso de 1-GC não é suficiente para detectar os compostos necessários, sendo provado no trabalho em questão que a separação de segunda dimensão é muito mais benéfica nos cromatogramas, na visibilidade dos picos e se o objetivo for uma técnica rápida de identidade de uma amostra essa técnica seria a melhor opção.

A identificação de Contaminantes em alimentos foi uma opção de análise bidimensional GCxGC para Peter Korytár, Leonards, P.EG . de Boer, J . e Brinkman, U.A.Th . Segundo os autores:

“[...]os efeitos prejudiciais à saúde dos bifenilos policlorados (PCBs) se tornaram claros, tem havido uma necessidade contínua de sua medição confiável em amostras de alimentos. As análises de PCB se concentram principalmente na determinação de marcadores congêneres (CBs 28, 52, 101, 118, 138, 153 e 180), que são os congêneres predominantemente encontrados em humanos e em alimentos de origem animal.”

Em seu estudo foi organizado com uma mistura padrão a ser usada nas amostras para identificar quantitativamente suas concentrações, assim como o preparo da amostra de fígado de bacalhau colocada na coluna e eluída para coleta de CB para continuidade nos processos seguintes. Não diferente de alguns outros trabalhos, os autores também compararam o método de análise GC e GCxGC para que as diferenças de montagem e condições pudessem ser vistas e discutidas durante o processo de desenvolvimento de análise e apontam que “No entanto, essa comparação muitas vezes não é válida, porque em GC × GC a coluna de primeira dimensão frequentemente tem uma eficiência mais baixa do que a coluna normalmente usada em uma separação unidimensional” (Korytár,Peter. et. Al, 2002). Logo, usaram coluna eficiente em GC como eles normalmente usavam para a comparação dos cromatogramas mostrando sempre os resultados dos picos de um método e outro.

Ainda na Análise de GCxGC, baseado na ideia de que “[...] uma fase não polar é geralmente preferida. Uma fase estacionária 5% fenil-, 95% dimetilpolissiloxano é apenas ligeiramente polar e é freqüentemente usada para separações GC unidimensionais de rotina de PCBs; portanto, características de retenção para muitos congêneres” (Korytár,Peter. et. Al, 2002) selecionaram a primeira coluna e na opção de segunda coluna testaram três modelos para que pudesse comparar a mais adequada. Levou-se em conta a otimização de temperatura que é muito importante no processo. De todos os cromatogramas apontados e tabelas de concentrações não pode-se optar pela preferência do uso de GCxGC mais, puderam afirmar seus pontos mais relevantes e adequados, até mesmo quando discutido sobre os limites de detecção observados, ou seja, o método pode ser usado para esta finalidade desde que em condições ideais.

Os Voláteis também estão envolvidos nos estudos de GCxGC como técnica de análise, porém em muitos trabalho de cromatografia bidimensional abrangente ele está acoplado ou sendo comparado a outras técnicas em uma determinada análise (Rochat, S. et Al.,2007; Wieczorek, M. N. et Al.,2020; Li, Shujing; et Al., 2020).

Na pesquisa desenvolvida por Sabine Rochat, Jean-Yves de Saint Laumer e Alain Chaintreau é observada a aplicação da técnica de GCxGC para análise de compostos de enxofre do aroma de rosbife, não sendo esta a única técnica do trabalho. Baseado em pesquisas anteriores os mesmos escolheram a técnica por considerá-la mais sensível e apropriada para detecção de novos compostos voláteis na amostra em questão. Em continuidade a trabalhos anteriores os mesmos fizeram então o preparo da amostra, deixaram o equipamento adequado para o tipo de análise, logo com a melhor colunas e temperatura de interesse e a partir disso obtiveram bons resultados, combinado com outros dois tipos de técnica os autores conseguiram identificar os compostos de enxofre de interesse e valorização a técnica GCxGC por facilitar a identificação de compostos, por ser mais sensível e ter um cromatograma com picos e resoluções de interesse.

A técnica GCxGC esta sendo uma opção para muito estudiosos que querem otimizar e facilitar a identificação por exemplo, de compostos em uma amostra complexa.

Ligações externas

• LECO
• Zoex
• Shimadzu