Citometria de fluxo

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Análise em uma citometria de fluxo

Citometria de fluxo é uma técnica utilizada para contar, examinar e classificar partículas microscópicas suspensas em meio líquido em fluxo. Permite a análise de vários parâmetros simultaneamente, sendo conhecida também por citometria de fluxo multiparamétrica. Através de um aparelho de detecção óptico-eletrônico são possíveis análises de características físicas e/ou químicas de uma simples célula.

Princípio[editar | editar código-fonte]

Um feixe de luz (normalmente laser) de um único comprimento de onda (cor) é direccionado a um meio líquido em fluxo. Um número de dectores são apontados ao local onde o fluxo passa através do feixe de luz; um na linha do feixe de luz (Forward Scatter ou FSC) e vários perpendiculares a este (Side Scatter ou SSC) além de um ou mais detectores fluorescentes. Cada partícula suspensa passando através do feixe dispersa a luz de uma forma, e os corantes químicos fluorescentes encontrados na partícula ou juntos a partícula podem ser excitados emitindo luz de menor frequência do que o da fonte de luz. Esta combinação de luz dispersa e fluorescente é melhorada pelos dectetores, e analisando as flutuações de brilho de cada detector (uma para cada pico de emissão fluorescente) é possível explorar vários tipos de informação sobre a estrutura física e química de cada individual partícula. FSC correlaciona-se com o volume celular e SSC depende da complexidade interna da partícula (por exemplo: forma do núcleo, quantidade e tipo dos grânulos citoplasmáticos e rugosidade da membrana). Alguns citômetros de fluxo do mercado tem eliminado a necessidade da fluorescência e usado somente dispersão de luz para sua medição. Outros citômetros de fluxo formam imagens de cada fluorescência da célula, dispersão de luz e transmissão de luz.

Citômetros de fluxo[editar | editar código-fonte]

Citômetro de Fluxo Becton-Dickinson FACSCalibur

Os citômetros de fluxo modernos são capazes de analisar várias partículas em cada segundo em "tempo real" e podem ativamente separar e isolar partículas com propriedades específicas. Um citômetro de fluxo é similar a um microscópio que produz, ao invés de imagens da célula, uma quantificação de um conjunto de parâmetros. Para análise de tecidos biológicos é necessária a preparação de uma suspensão de células.

Um citômetro de fluxo tem 5 principais componentes:

  • um fluxo de células
  • uma fonte de luz - normalmente são usadas lâmpadas (mercúrio, xenon); lasers de alto poder (argon, kripton); lasers de poder baixo (argon (488 nm), red-HeNe (633 nm), green-HeNe, HeCd (UV)) e lasers de diodo (azul, verde, vermelho e violeta).
  • um detector e conversor de sistema analógico para digital (ADC) - gerando parâmetros de tamanho e complexidade, assim como sinais fluorescentes.
  • um sistema de amplificação - linear ou logarítimico.
  • um computador para análise de sinais.

Parâmetros medidos[editar | editar código-fonte]

Os parâmetros possíveis de medir são: volume e complexidade morfológica das células, pigmentos celulares como clorofila, ADN (análise de tipo de células, cinética celular, proliferação, etc.), RNA, análise e classificação de cromossomas, proteínas, antigénios à superfície celular (marcadores CD), antigénios intracelulares (várias citosinas, mediadores secundários, etc.), antigénios nucleares, actividade enzimática, pH, cálcio ionizado intracelular, magnésio, potencial membranar, fluidez membranar, apoptose (quantificação, medidas da degradação do DNA, potencial da membrana mitocondrial, alterações na permeabilidade, actividade da caspase), viabilidade celular, monitorização da electropermeabilização das células, caracterização da multi resistência a fármacos em células tumorais, glutationa, várias combinações (ADN/antigénios de superfície, etc.). Esta lista é muito longa e está em constante expansão.

Principais aplicações[editar | editar código-fonte]

A hematologia foi uma das primeiras disciplinas médicas a se beneficiar das aplicações clínicas da citometria de fluxo. Algumas destas aplicações são atualmente utilizadas regularmente para o diagnóstico ou a seguinte terapêutica das diferentes afecções. Estas aplicações concernem bem também ao estudo funcional das células sadias que coloca em evidência a natureza patológica das células analisadas.

Em cancerologia, a detecção da célula patológica é a aplicação mais desenvolvida. Esta detecção reposa esencialmente sobre a medição de um conteúdo anormal de DNA no núcleo da célula tumoral.

A imunologia utiliza a citometria de fluxo para a detecção ou identificação de sub-tipos de células implicadas na imunidade.

O ciclo celular representa a integralidade do período de divisão, pode-se dizer, o conjunto de acontecimentos bioquímicos e morfológicos que são responsáveis pela proliferação celular. A citometria oferece uma metodologia rápida e simples de se colocar em obra para analisar o ciclo celular. Ela permite de acompanhar a distribuição das células nas diferentes fases do cicle em função de diversos estímulos ou da adição de algumas drogas. Ela permite também ver a presença de células com os conteúdos anormais de DNA.

Numerosos estudos em farmacologia referentes a citometria de fluxo dão enfoque em estudos de drogas anti-mitóticas, imunoterapia.

Em oceanografia, a citometria de fluxo tornou-se um método de rotina para contar as diferentes populações de Picoplancton fotossintética sob a base da fluorescência de pigmentos semelhante a clorofila.

As outras pesquisas são referentes a análise de cromossomos, fisiologia vegetal (para a seleção de plantas mais resistentes), etc.