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O sistema CRISPR (do inglês Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats), ou seja, Repetições Palindrômicas Curtas Agrupadas e Regularmente Interespaçadas, consiste em pequenas porções do DNA bacteriano compostas por repetições de nucleotídeos. Cada uma dessas repetições encontra-se adjacente a um “protoespaçador” (“espaçador de DNA”), que corresponde a uma região não-codante inserida no DNA bacteriano após o contato com genomas invasores provenientes de bacteriófagos ou plasmídeos. A transcrição do locus CRISPR resulta em pequenos fragmentos de RNA com capacidade de desempenhar o reconhecimento de um DNA exógeno específico e atuar como um guia de modo a orientar a nuclease Cas, que irá promover a clivagem e consequente eliminação do DNA invasor caso este entre novamente em contato com a bactéria, atuando como importante mecanismo de defesa contra DNAs invasores ^[1]^[2].

Diversos são os mecanismos pelos quais a molécula de RNA guia pode ser sintetizada, entretanto, o sistema tipo II no qual baseiam-se os sistemas atualmente disponíveis para realização da edição gênica, requer a presença de um RNA transativador (tracRNA), e uma molécula pequena de RNA complementar à sequência repetida capaz de associar-se ao transcrito inicial do locus CRISPR, denominada CRISPR RNA (crRNA-sequências que consistem em um protoespaçador ligado a uma sequência repetida com estrutura de grampo). Esta associação origina o complexo tracRNA-crRNA, uma molécula de RNA dupla fita que após ser processada pela RNase III é convertida em uma molécula híbrida madura com função importante no que diz respeito à associação e direcionamento de uma nuclease para eliminação do DNA invasor. Nesse sistema especificamente, a nuclease envolvida na clivagem refere-se à Proteína Associada a CRISPR 9 (Cas9) ^[1]^[2].

A alta taxa de insucesso, custo elevado e excesso de tempo necessário para realização das metodologias disponíveis para edição gênica, tais como Recombinação Homóloga (comumente empregada na manipulação genica de células tronco), Nucleases Dedos de Zinco (ZFN, do inglês Zinc Fingers Nucleases) e Nucleases Efetoras semelhantes à Ativadores de Transcrição (TALENs, do inglês Transcription Activator–like Effector Nucleases), estas duas últimas requerem o reconhecimento em ambas as fitas de DNA para que a clivagem promovida por nucleases sintetizadas especificamente para tais metodologias seja bem sucedida, o que nos permite considerar tais métodos mais trabalhosos quando comparados ao sistema CRISPR ^[3].

A junção de todos estes fatores fez com que a recente descoberta de um sistema imune bacteriano contra fagos e plasmídeos invasores ganhasse destaque no que diz respeito a técnicas de edição gênica e obtenção de organismos geneticamente modificados (OGMs) ^[2]^[4]^[5].

Atualmente encontra-se disponível um gRNA (RNA guia) que consiste na construção de uma molécula de RNA desenvolvida biotecnologicamente, com a capacidade de mimetizar o que ocorre naturalmente em bactérias, e desta forma, promover o direcionamento da nuclease Cas9 para uma sequência alvo específica para que esta promova a clivagem e a sequência de interesse tornando esta disponível para atuação da maquinaria de reparo da célula e assim, promover edição da porção de interesse presente no genoma alvo. Tais fundamentos nos permitem considerar o sistema CRISPR uma técnica rápida, com relativa facilidade de manipulação e baixo custo quando comparada a técnicas anteriores ^[1]^[5].

História

Originalmente encontradas no genoma de Escherichia coli em 1987 e descritas por Ishino e colaboradores ^[6], as sequências curtas intercaladas regularmente só começaram realmente a ser investigadas no início dos anos 2000, sendo então encontradas em diversos outros organismos procarióticos, tanto do domínio Bactéria, quanto Archaea ^[7], e em 2002 a sigla CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats) foi criada para denominar tais sequências ^[8].

Somente em 2005 foram obtidas as informações necessárias para indicar a função destes loci. Foi descrito que as sequências espaçadoras têm origem extracromossômica, sendo derivadas de sequências de plasmídeos ou de vírus. Além disso, foi também descrito que vírus tornam incapazes de infectar arqueias que possuem sequências espaçadoras correspondentes ao seu genoma, inseridas após uma infecção prévia ^[9]^[10]^[11]^[12].

No ano seguinte foi postulada a hipótese de que o CRISPR é um sistema de defesa adaptativo de bactérias e arqueias que faz uso de RNA antisenso como assinaturas de memória de invasões anteriores ^[13]. Esta proposta recebeu o suporte necessário quando foi evidenciada experimentalmente em Streptococcus thermophilus ^[14], levando a sua primeira aplicação no campo da biotecnologia, a fim de imunizar bactérias utilizadas na indústria de laticínios contra infecção por bacteriófagos ^[15].

Evidências obtidas em seguida mostraram que as sequências espaçadoras de DNA invasor intercaladas com os arranjos de repetições intrínsecas são transcritos em grandes moléculas de RNAs, e estas são cortadas em pedaços menores pela nuclease Cas9 auxiliada pelo tracrRNA, tornando-se crRNAs, que por sua vez formam complexos com as proteínas tipo Cas. O complexo age de forma a impedir a proliferação viral em bactérias, devido a capacidade de clivagem do DNA invasor pela Cas9, o complexo tracrRNA-crRNA tem um papel fundamental no direcionamento desta nuclease, tendo o DNA invasor como alvo ^[16]^[17]^[18]. Nos últimos anos, estudos mostraram que aparentemente a Cas9 é a principal nuclease envolvida no processo de clivagem de DNA invasor ^[19]^[20] dentre os vários tipos de Cas descritos, algumas ainda precisam ter suas funções elucidadas.

Em 2011, foi demonstrado que é possível transferir a memória imune de uma espécie de bactéria para outra, gerando novas possibilidades de aplicações do mecanismo ^[21], o que levou aos estudos que mostraram que Cas9 purificadas são capazes de clivar DNA alvo in vitro quando guiadas por crRNAs ^[22]^[23]. O que resultou na utilização do sistema CRISPR como uma ferramenta de engenharia genética, tornando possível editar com sucesso o genoma de células de mamíferos, assim como de inúmeros outros sistemas modelos ^[2]^[24]^[25].

Diversidade do Sistema

O locus CRISPR é composto por cerca de 20 a 50 pares de base, normalmente dispostos simetricamente, o que favorece a formação de uma estrutura em “grampo” ou “hairpin”. Neste locus são encontradas repetições separadas por protoespaçadores de tamanho similar, os quais podem ser adicionados rapidamente como parte da resposta imune bacteriana contra infecção ocasionada por fagos além de variar em tamanho e sequência ^[1]^[9].

Têm sido descrito que dentre os 198 genomas completos disponíveis no banco de dados NCBI, é possível encontrar cerca de 50 genomas onde o gene Cas1 está presente ^[9]. Além disso, sabe-se que a grande maioria dos “protoespaçadores” possui homologia com genes conhecidos, frequentemente provenientes de elementos extra-cromossômicos tais como fagos e plasmídeos ^[9]. Em Yersinia pestis estas repetições ocorrem preferencialmente pela absorção do DNA de bacteriófagos ^[1].

O primeiro estudo demonstrando como ocorre o direcionamento do complexo CRISPR/Cas9, de modo a permitir a ligação com a sequência complementar do gene alvo, e eliminação de um agente infeccioso em bactérias ocorreu em Streptococcus thermophilus em 2010 ^[1]^[19].

Atualmente, sabe-se que este distinto sistema imune pode ser dividido em três tipos principais, baseado na conservação dos genes e organização dos loci (CRISPR Tipo I, Tipo II e Tipo III) ^[26].

Uma particularidade do sistema CRISPR Tipo I se dá pela presença de ao menos um gene que codifique a nuclease Cas3, a qual participa ativamente na clivagem de uma molécula de DNA invasor ^[26].

O sistema CRISPR Tipo II é considerado o mais robusto para aquisição de plasmídeos e fagos. Nele são encontrados apenas quatro genes, dentre os quais sempre haverá ao menos um gene que codifique a nuclease Cas9, a qual pode participar tanto no processamento de RNA quanto na eliminação do DNA alvo ^[4]^[26]^.

Uma peculiaridade pode ser observada no sistema CRISPR Tipo III, que foi subsequentemente dividido em dois subtipos. Tais sistemas foram denominados como CRISPR TipoIII-A, o qual é capaz de atuar sobre DNA plasmidial in vivo, e CRISPR Tipo III-B responsável pela clivagem apenas de RNA fita simples in vitro. Estas observações sugerem que seja possível a existência de diferentes mecanismos de atuação envolvendo subtipos distintos de CRISPR ^[1]^[26].

Vale ressaltar a possibilidade de encontrar mais de um sistema CRISPR em um mesmo organismo, o que claramente demonstra a compatibilidade entre estes sistemas, bem como a possibilidade de compartilhamento dos componentes funcionais presentes nos diferentes sistemas ^[1]^.

Recentemente, verificou-se a capacidade de fagos em promover mutações em seu genoma de modo a conseguir evadir a resposta imune bacteriana. Esta capacidade tem sido considerada o modelo básico de evolução CRISPR, uma vez que tais mutações impossibilitam a complementaridade do sistema tracRNA/crRNA com o fago e, portanto, impedem a associação com a nuclease Cas9 e a subsequente clivagem do DNA invasor ^[16]^[27].

Mecanismo de Atuação da CRISPR

De maneira geral, todos os mecanismos CRISPR expressam as mesmas vias de aquisição, expressão e interferência, conforme descrito a seguir ^[26]:

a) Aquisição de novos protoespaçadores: Geralmente realizada através do reconhecimento e clivagem de ácidos nucleicos exógenos mediados por Cas1 e Cas2 para sua integração ao cromossomo bacteriano em regiões conhecidas como locus CRISPR ^[26].

b) Transcrição completa do locus CRISPR como um pre-crRNA: Processamento e amadurecimento do transcrito em pequenas moléculas de RNA (crRNA) capazes de reconhecer uma única sequencia alvo ^[26].

c) Associação com proteínas Cas: Formação de complexo ribonuclear capaz de guiar nucleases de maneira especifica em direção ao DNA alvo presente em bacteriofagos e plasmídeos ^[26].

3.1. AQUISIÇÃO DE PROTOESPAÇADORES

A integração de uma nova informação nos loci CRISPR inicia-se pela imunidade bacteriana mediada por esse sistema, onde uma pequena porção do DNA invasor, é integrada ao locus CRISPR do hospedeiro como um protoespaçador através da atuação de nucleases específicas ^[1].

Devido à alta afinidade encontrada entre a nucleasse Cas1 e ácidos nucléicos, tem sido sugerido que esta enzima possua papel significativo no que se refere a integração e aquisição de novos protoespaçadores. Além disso, a ausência de necessidade de uma sequencia especifica de nucleotídeos para o acontecimento deste tipo de ligação com a Cas1 reforça esta idéia, uma vez que esta poderia atuar sobre qualquer seqüência protoespaçadora presente no genoma viral ^[1].

Outro ponto importante a ser destacado no que diz respeito a aquisição de novos protoespaçadores é a importância da manutenção da estrutura do locus. Desta forma, seguida da adição de um novo protoespaçador, uma nova sequencia de repetição CRISPR é sintetizada favorecendo a organização “repeat-spacer-repeat”, essencial para o reconhecimento do locus CRISPR ^[1].

Ficheiro:Estrutura do locus CRISPR

A organização do locus CRISPR tem sido sugerida como ferramenta de grande valia para a distinção entre um DNA invasor e o do genoma hospedeiro pela maquinaria de reparo celular. Além disso, há relatos de que a seqüência líder possua elementos capazes de promover o recrutamento deste mecanismo de reparo celular de modo a favorecer a integração do protoespaçador no DNA bacteriano ^[1].

Os sinais moleculares envolvidos neste processo de distinção ainda não estão completamente elucidados. Contudo, o mapeamento das seqüências espaçadoras presentes nos genomas virais revelam uma seqüência de poucos nucleotídeos de comprimento próxima ao protoespaçador, denominada Motivo Adjacente ao Protoespaçador (Protospacer Adjacent Motif - PAM) ^[9]^[28].

Cada domínio PAM pode ter a sequência variável de acordo com o tipo de sistema CRISPR, sugerindo que proteínas Cas presentes nos distintos tipos de CRISPR estejam envolvidas no reconhecimento do domínio PAM ^[1]^[4]^[29].

3.2. TRANSCRIÇÃO DO Locus CRISPR

3.2.1. Tipo I

O sistema CRISPR Tipo I pode ser dividido em 6 subtipos categorizados de A a F. Neste sistema, a transcrição do locus CRISPR é seguida pela dobragem sobre si mesma das sequências repetidas para formar estruturas em grampo (hairpins) entre os protoespaçadores, seguida da clivagem do transcrito mediada pela nuclease Cas6e/f originando crRNA ^[30]. Um complexo efetor conhecido como Cascade (Complexo associado a CRISPR para defesa antiviral) reúne cinco proteínas Cas ^[30]^[31] ligadas ao crRNA. Este complexo é direcionado à sequência apropriada presente no DNA invasor por meio de reconhecimento do domínio PAM na fita complementar do crRNA ^[32]. Uma vez que a identificação da sequência tenha sido estabelecida, uma mudança conformacional em Cascade recruta Cas3, a qual cliva o ácido nucleico invasor de modo sequência-específica ^[30].

3.2.2. Tipo II

O sistema do tipo II é comumente encontrado em Archaea e pode ser dividido em 3 subtipos distribuídos de A a C ^[30].

Neste caso, a transcrição do locus CRISPR é seguida pelo pareamento de bases do tracrRNA à sequência repetida localizada entre os protoespaçadores ^[30]. A clivagem do dsRNA pela RNaseIII em fragmentos de sequências formadas por um único proto-espaçador ^[33] juntamente com a porção 3’ da sequência repetida é denominado crRNA ^[29]. O tracrRNA se liga à sequência repetida complementar do crRNA e essa molécula híbrida associa-se à nuclease Cas9 para promover o seu direcionamento à sequência apropriada do DNA invasor usando o domínio PAM como guia ^[29]. A proteína Cas 9 é constituída por cerca de 800-1400 aminoácidos, com uma estrutura de 2 lóbulos ^[34] que possui dois sítios com atividade nuclease: O RuvC-like (RNase-H fold) responsável pela clivagem da sequencia não alvo e o domínio HNH (McrA-like) responsável pela clivagem da sequencia alvo ^[29]. Posterior ao reconhecimento, a clivagem do DNA invasor mediada pelo complexo Cas9-crRNA-tracrRNA é realizada importante destacar que ao contrario do sistema Tipo I, o reconhecimento do domínio PAM no sistema Tipo II ocorre na mesma fita do crRNA ^[35]

1.1.3. Tipo III

Sistemas CRISPER CAS Tipo III compreendem dois subtipos, III-A e III-B, ambos possuem o gene CAS 10 específico dos sistemas Tipo III, entretanto podem ser diferenciados pelos genes acessórios: csm no subtipo III-A e cmr no subtipo IIIB ^{(Marakova
2011)}.Além disso, eles não requerem domínios PAM para o reconhecimento da sequencia alvo por parte do crRNA ou para sua clivagem ^{(Lundgrenetal 2015)}.A transcrição do locus CRISPR é seguida pela ligação do transcrito ao redor de Cas6 e pela clivagem 8 nucleotídeos a montante da junção entre a sequência repetida e o protoespaçador. Isto resulta em uma série de protoespaçadores com sequências repetidas nos dois extremos, 5’ e 3’, similar aso Tipo II ^{(Lundgrenetal 2015)}.Entretanto, enquanto no Tipo II a clivagem é realizada no extremo 5’ deixando a porção 3’ da sequência repetida ligada ao proto-espaçador, no Tipo III a clivagem ocorre no extremo 3’ e deixa cada proto-espaçador com a porção 5’ da sequência repetida ^{(Lundgrenetal 2015)}.

No Tipo III-A a maturação do crRNA intermediário é essencial para a interferência dirigida. De fato, enquanto os crRNAs intermediários podem ser ligados dentro do complexo proteico csm-Cas10 (conforme mencionado abaixo), o subsequente complexo ribonucleoprotéico é incapaz de degradar o DNA invasor ^{(Hatoum-Aslan
et al. 2014)}.

No Tipo III-B o crRNA é tomado pelo complexo de proteínas conhecido como cmr (módulo Cas RAMP, proteínas misteriosas associadas a repetições) ^{(Haleet. al 2009)}. Diferentes proteínas membros dos módulos RAMP podem ser expressas entre diversas espécies. Os complexos cmr usualmente consistem de várias proteínas Cas (tipicamente Cas1-6) ^{(Haleetal 2012)}. De fato, existem diversas famílias identificadas dos complexos cmr que quando complexadas com Cas10 realizam clivagem de RNA através da interação de complementaridade de pares de bases do crRNA com o RNA invasor ^{(Haftetal
2005)}.

Os sistemas do Tipo III-A são geralmente caraterizados pela presença de genes csm (tipicamente csm 2-5 – membros da superfamília RAMP) os quais, da mesma forma que os genes cmr, codificam para proteínas envolvidas na formação do complexo com Cas10 e subsequente degradação do DNA invasor guiado por crRNA, num modo sequência específico ^{(Lundgrenetal 2015)}.

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[8] Jansen, Ruud.; Jan. D. A. van (1 de março de 2002). «Identification of genes that are associated with DNA repeats in prokaryotes». Molecular Microbiology (em inglês). 43 (6): 1565-1575. ISSN 1365-2958. doi:10.1046/j.1365-2958.2002.02839.x

[:4-9] Bolotin, A.; Alexander Bolotin|Benoit Quinquis|Alexei Sorokin|S. Dusko (1 de janeiro de 2005). «Clustered regularly interspaced short palindrome repeats (CRISPRs) have spacers of extrachromosomal origin». Microbiology. 151 (8). doi:10.1099/mic.0.28048-0

[10] Mojica, Francisco J. M.; Chc)sar (1 de fevereiro de 2005). «Intervening Sequences of Regularly Spaced Prokaryotic Repeats Derive from Foreign Genetic Elements». Journal of Molecular Evolution (em inglês). 60 (2): 174-182. ISSN 0022-2844. doi:10.1007/s00239-004-0046-3

[11] Pourcel, C.; C. Pourcel|G. Salvignol|G. (1 de janeiro de 2005). «CRISPR elements in Yersinia pestis acquire new repeats by preferential uptake of bacteriophage DNA, and provide additional tools for evolutionary studies». Microbiology. 151 (3). doi:10.1099/mic.0.27437-0

[12] Mojica, Francisco J. M.; Chc)sar (1 de fevereiro de 2005). «Intervening Sequences of Regularly Spaced Prokaryotic Repeats Derive from Foreign Genetic Elements». Journal of Molecular Evolution (em inglês). 60 (2): 174-182. ISSN 0022-2844. doi:10.1007/s00239-004-0046-3

[13] Makarova, Kira S.; Nick V. (16 de março de 2006). «A putative RNA-interference-based immune system in prokaryotes: computational analysis of the predicted enzymatic machinery, functional analogies with eukaryotic RNAi, and hypothetical mechanisms of action». Biology Direct (em inglês). 1 (1). 7 páginas. ISSN 1745-6150. PMID 16545108. doi:10.1186/1745-6150-1-7

[14] Barrangou, Rodolphe; Christophe (23 de março de 2007). «CRISPR Provides Acquired Resistance Against Viruses in Prokaryotes». Science (em inglês). 315 (5819): 1709-1712. ISSN 0036-8075. PMID 17379808. doi:10.1126/science.1138140

[15] Barrangou, Rodolphe; Philippe (1 de janeiro de 2012). «CRISPR: New Horizons in Phage Resistance and Strain Identification». Annual Review of Food Science and Technology. 3 (1): 143-162. PMID 22224556. doi:10.1146/annurev-food-022811-101134

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[17] Brouns, Stan J. J.; Matthijs M. (15 de agosto de 2008). «Small CRISPR RNAs Guide Antiviral Defense in Prokaryotes». Science (em inglês). 321 (5891): 960-964. ISSN 0036-8075. PMID 18703739. doi:10.1126/science.1159689

[18] Marraffini, Luciano A.; Erik J. (19 de dezembro de 2008). «CRISPR Interference Limits Horizontal Gene Transfer in Staphylococci by Targeting DNA». Science (em inglês). 322 (5909): 1843-1845. ISSN 0036-8075. PMID 19095942. doi:10.1126/science.1165771

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[22] Jinek, Martin; Krzysztof (17 de agosto de 2012). «A Programmable Dual-RNA–Guided DNA Endonuclease in Adaptive Bacterial Immunity». Science (em inglês). 337 (6096): 816-821. ISSN 0036-8075. PMID 22745249. doi:10.1126/science.1225829

[23] Gasiunas, Giedrius; Rodolphe (25 de setembro de 2012). «Cas9–crRNA ribonucleoprotein complex mediates specific DNA cleavage for adaptive immunity in bacteria». Proceedings of the National Academy of Sciences (em inglês). 109 (39): E2579-E2586. ISSN 0027-8424. PMID 22949671. doi:10.1073/pnas.1208507109

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[:7-26] ↑ ^a ^b ^c ^d ^e ^f ^g ^h Makarova, Kira S.; Daniel H. (1 de janeiro de 2011). «Evolution and classification of the CRISPR–Cas systems». Nature Reviews Microbiology. 9 (6). PMID 21552286. doi:10.1038/nrmicro2577

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[31] Wiedenheft, Blake. «Structures of the RNA-guided surveillance complex from a bacterial immune system». NATURE. doi:10.1038/nature10402

[32] «CRISPR» (em inglês)

[33] Deltcheva, Elitza; Krzysztof (1 de janeiro de 2011). «CRISPR RNA maturation by trans-encoded small RNA and host factor RNase III». Nature. 471 (7340). PMID 21455174. doi:10.1038/nature09886

[34] Nishimasu, Hiroshi; F. Ann. «Crystal Structure of Cas9 in Complex with Guide RNA and Target DNA». Cell (em English). 156 (5): 935-949. ISSN 0092-8674. PMID 24529477. doi:10.1016/j.cell.2014.02.001

[35] Haft, Daniel H; Jeremy (11 de novembro de 2005). «A Guild of 45 CRISPR-Associated (Cas) Protein Families and Multiple CRISPR/Cas Subtypes Exist in Prokaryotic Genomes». PLoS Comput Biol. 1 (6): e60. PMID 16292354. doi:10.1371/journal.pcbi.0010060

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 A alta taxa de insucesso, custo elevado e excesso de tempo necessário para realização das metodologias disponíveis para edição gênica, tais como Recombinação Homóloga (comumente empregada na manipulação genica de células tronco), Nucleases Dedos de Zinco (ZFN, do inglês ''Zinc Fingers Nucleases'') e Nucleases Efetoras semelhantes à Ativadores de Transcrição (TALENs, do inglês ''Transcription Activator–like Effector Nucleases''), estas duas últimas requerem o reconhecimento em ambas as fitas de DNA para que a clivagem promovida por nucleases sintetizadas especificamente para tais metodologias seja bem sucedida, o que nos permite considerar tais métodos mais trabalhosos quando comparados ao sistema CRISPR <ref>{{Citar periódico|titulo = RNA-dependent DNA endonuclease Cas9 of the CRISPR system: Holy Grail of genome editing?|url = http://www.cell.com/article/S0966842X13001789/abstract|jornal = Trends in Microbiology|data = 2013-01-11|issn = 0966-842X|pmid = 24095303|paginas = 562-567|volume = 21|numero = 11|doi = 10.1016/j.tim.2013.09.001|idioma = English|primeiro = Giedrius|ultimo = Gasiunas|coautores = Virginijus}}</ref>.
-A junção de todos estes fatores fez com que a recente descoberta de um sistema imune bacteriano contra fagos e plasmídeos invasores ganhasse destaque no que diz respeito a técnicas de edição gênica e obtenção de organismos geneticamente modificados (OGMs) <ref name=":1" /><ref>{{Citar periódico|titulo = Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system|url = http://www.nature.com/doifinder/10.1038/nprot.2013.143|jornal = Nature Protocols|data = 2013-01-01|pmid = 24157548|volume = 8|numero = 11|doi = 10.1038/nprot.2013.143|primeiro = F Ann|ultimo = Ran|coautores = Patrick D}}</ref><ref name=":2">{{Citar periódico|titulo = CRISPR Provides Acquired Resistance Against Viruses in Prokaryotes|url = http://www.sciencemag.org/content/315/5819/1709|jornal = Science|data = 2007-03-23|issn = 0036-8075|pmid = 17379808|paginas = 1709-1712|volume = 315|numero = 5819|doi = 10.1126/science.1138140|idioma = en|primeiro = Rodolphe|ultimo = Barrangou|coautores = Christophe}}</ref>.
+A junção de todos estes fatores fez com que a recente descoberta de um sistema imune bacteriano contra fagos e plasmídeos invasores ganhasse destaque no que diz respeito a técnicas de edição gênica e obtenção de organismos geneticamente modificados (OGMs) <ref name=":1" /><ref name=":3">{{Citar periódico|titulo = Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system|url = http://www.nature.com/doifinder/10.1038/nprot.2013.143|jornal = Nature Protocols|data = 2013-01-01|pmid = 24157548|volume = 8|numero = 11|doi = 10.1038/nprot.2013.143|primeiro = F Ann|ultimo = Ran|coautores = Patrick D}}</ref><ref name=":2">{{Citar periódico|titulo = CRISPR Provides Acquired Resistance Against Viruses in Prokaryotes|url = http://www.sciencemag.org/content/315/5819/1709|jornal = Science|data = 2007-03-23|issn = 0036-8075|pmid = 17379808|paginas = 1709-1712|volume = 315|numero = 5819|doi = 10.1126/science.1138140|idioma = en|primeiro = Rodolphe|ultimo = Barrangou|coautores = Christophe}}</ref>.
-Atualmente encontra-se disponível um gRNA (RNA guia) que consiste na construção de uma molécula de RNA desenvolvida biotecnologicamente, com a capacidade de mimetizar o que ocorre naturalmente em bactérias, e desta forma, promover o direcionamento da nuclease Cas9 para uma sequência alvo específica para que esta promova a clivagem e a sequência de interesse tornando esta disponível para atuação da maquinaria de reparo da célula e assim, promover edição da porção de interesse presente no genoma alvo. Tais fundamentos nos permitem considerar o sistema CRISPR uma técnica rápida, com relativa facilidade de manipulação e baixo custo quando comparada a técnicas anteriores <ref name=":0" /><ref name=":2" />.[[File:SimpleCRISPR.jpg|thumb|200px|Diagrama simplificado de um locus de CRISPR]]
+Atualmente encontra-se disponível um gRNA (RNA guia) que consiste na construção de uma molécula de RNA desenvolvida biotecnologicamente, com a capacidade de mimetizar o que ocorre naturalmente em bactérias, e desta forma, promover o direcionamento da nuclease Cas9 para uma sequência alvo específica para que esta promova a clivagem e a sequência de interesse tornando esta disponível para atuação da maquinaria de reparo da célula e assim, promover edição da porção de interesse presente no genoma alvo. Tais fundamentos nos permitem considerar o sistema CRISPR uma técnica rápida, com relativa facilidade de manipulação e baixo custo quando comparada a técnicas anteriores <ref name=":0" /><ref name=":2" />.<nowiki/>
-<nowiki/>
 ==História==
+Originalmente encontradas no genoma de ''Escherichia coli'' em 1987 e descritas por Ishino e colaboradores <ref>{{Citar periódico|titulo = Nucleotide sequence of the iap gene, responsible for alkaline phosphatase isozyme conversion in Escherichia coli, and identification of the gene product.|url = http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC213968/|jornal = Journal of Bacteriology|data = 1987-12-01|issn = 0021-9193|pmid = 3316184|paginas = 5429-5433|volume = 169|numero = 12|primeiro = Y|ultimo = Ishino|coautores = H}}</ref>, as sequências curtas intercaladas regularmente só começaram realmente a ser investigadas no início dos anos 2000, sendo então encontradas em diversos outros organismos procarióticos, tanto do domínio Bactéria, quanto Archaea <ref>{{Citar periódico|titulo = Biological significance of a family of regularly spaced repeats in the genomes of Archaea, Bacteria and mitochondria|url = http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1046/j.1365-2958.2000.01838.x/abstract|jornal = Molecular Microbiology|data = 2000-04-01|issn = 1365-2958|paginas = 244-246|volume = 36|numero = 1|doi = 10.1046/j.1365-2958.2000.01838.x|idioma = en|primeiro = Francisco J. M.|ultimo = Mojica|coautores = Cesar}}</ref>, e em 2002 a sigla CRISPR (''Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats'') foi criada para denominar tais sequências <ref>{{Citar periódico|titulo = Identification of genes that are associated with DNA repeats in prokaryotes|url = http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1046/j.1365-2958.2002.02839.x/abstract|jornal = Molecular Microbiology|data = 2002-03-01|issn = 1365-2958|paginas = 1565-1575|volume = 43|numero = 6|doi = 10.1046/j.1365-2958.2002.02839.x|idioma = en|primeiro = Ruud.|ultimo = Jansen|coautores = Jan. D. A. van}}</ref>.
-CRISPR é efetivamente uma de ocorrência natural, um mecanismo antigo de defesa encontrado em uma vasta gama de [[bactéria]]s. Em retrospecto, os pesquisadores provavelmente deveriam ter previsto que as [[bactéria]]s e [[archaea]] teriam sistemas imunológicos sofisticados. Afinal de contas, os [[vírus]] são os mais abundantes agentes biológicos do planeta, causando cerca de 10<sup>23</sup> infecções a cada segundo<ref>[http://www.nature.com/nrmicro/journal/v7/n11/full/nrmicro2235.html Explaining microbial population genomics through phage predation] por F. Rodriguez-Valera, et al (Nat Rev Microbiol, 7 ([[2009]]), pp. 828–836</ref><ref>[http://www.nature.com/nrmicro/journal/v5/n10/full/nrmicro1750.html Marine viruses - major players in the global ecosystem] por Curtis A. Suttle em "Nature Reviews Microbiology" 5, 801–812 ([[1 de outubro]] de [[2007]]) | doi:10.1038/nrmicro1750 </ref>. Já na década de [[1980]], os cientistas observaram um estranho padrão em alguns genomas bacterianos. Essas repetições foram descritas pela primeira vez em [[1987]] por [[Yoshizumi Ishino]] e colegas da [[Universidade de Osaka]], no [[Japão]] quando publicaram a sequência de um gene para a [[bactéria]] [[Escherichia coli]] para entender melhor como o gene trabalhava<ref name="pmid3316184">{{citar livro| vauthors = Ishino Y, Shinagawa H, Makino K, Amemura M, Nakata A | title = Nucleotide sequence of the iap gene, responsible for alkaline phosphatase isozyme conversion in Escherichia coli, and identification of the gene product | journal = Journal of Bacteriology | volume = 169 | issue = 12 | pages = 5429–5433 | date = Dec 1987 | pmid = 3316184 | pmc = 213968 }}</ref>.  CRISPR evoluiu através da aquisição de fragmentos curtos de ADN derivado de fagos e linhagens novas com espaçadores que são resistentes a estes fagos.
-[[File:Crystal Structure of Cas9 in Complex with Guide RNA and Target DNA.jpg|thumb|left|250px|Estrutura cristalina de [[Streptococcus pyogenes]] [[Cas9]] em complexo com sgRNA e o seu [[ADN]] alvo em resolução 2,5A˚.]]
-As repetições agrupamentos eram muito intrigante até que os cientistas perceberam as sequências únicas, entre as repetições combinava com o DNA de [[vírus]] especificamente vírus que atacam as bactérias. Foi descorberto que CRISPR é uma parte do [[sistema imunológico]] das bactérias, a parte que mantém pedaços de vírus perigosos ao redor para que abactéria possa reconhecer e se defender contra os vírus da próxima vez que eles ataquem. A segunda parte do mecanismo de defesa é um conjunto de enzimas chamadas Cas (CRISPR-associated proteins <small>proteínas associadas ao CRISPR</small>), que podem cortar precisamente DNA e cortam fora vírus invasores. Convenientemente, os genes que codificam o Cas estão sempre estacionados em algum lugar perto as seqüências CRISPR<ref>[https://www.quantamagazine.org/20150206-crispr-dna-editor-bacteria/ Breakthrough DNA Editor Borne of Bacteria] por Carl Zimmer em 6 de fevereiro de 2015</ref>.
+Somente em 2005 foram obtidas as informações necessárias para indicar a função destes ''loci''. Foi descrito que as sequências espaçadoras têm origem extracromossômica, sendo derivadas de sequências de plasmídeos ou de vírus. Além disso, foi também descrito que vírus tornam incapazes de infectar arqueias que possuem sequências espaçadoras correspondentes ao seu genoma, inseridas após uma infecção prévia <ref name=":4">{{Citar periódico|titulo = Clustered regularly interspaced short palindrome repeats (CRISPRs) have spacers of extrachromosomal origin|url = http://mic.sgmjournals.org/content/journal/micro/10.1099/mic.0.28048-0|jornal = Microbiology|data = 2005-01-01|volume = 151|numero = 8|doi = 10.1099/mic.0.28048-0|primeiro = A.|ultimo = Bolotin|coautores = Alexander Bolotin{{!}}Benoit Quinquis{{!}}Alexei Sorokin{{!}}S. Dusko}}</ref><ref>{{Citar periódico|titulo = Intervening Sequences of Regularly Spaced Prokaryotic Repeats Derive from Foreign Genetic Elements|url = http://link.springer.com/article/10.1007/s00239-004-0046-3|jornal = Journal of Molecular Evolution|data = 2005-02-01|issn = 0022-2844|paginas = 174-182|volume = 60|numero = 2|doi = 10.1007/s00239-004-0046-3|idioma = en|primeiro = Francisco J. M.|ultimo = Mojica|coautores = Chc)sar}}</ref><ref>{{Citar periódico|titulo = CRISPR elements in Yersinia pestis acquire new repeats by preferential uptake of bacteriophage DNA, and provide additional tools for evolutionary studies|url = http://mic.sgmjournals.org/content/journal/micro/10.1099/mic.0.27437-0|jornal = Microbiology|data = 2005-01-01|volume = 151|numero = 3|doi = 10.1099/mic.0.27437-0|primeiro = C.|ultimo = Pourcel|coautores = C. Pourcel{{!}}G. Salvignol{{!}}G.}}</ref><ref>{{Citar periódico|titulo = Intervening Sequences of Regularly Spaced Prokaryotic Repeats Derive from Foreign Genetic Elements|url = http://link.springer.com/article/10.1007/s00239-004-0046-3|jornal = Journal of Molecular Evolution|data = 2005-02-01|issn = 0022-2844|paginas = 174-182|volume = 60|numero = 2|doi = 10.1007/s00239-004-0046-3|idioma = en|primeiro = Francisco J. M.|ultimo = Mojica|coautores = Chc)sar}}</ref>.
-Ficou imediatamente claro que este documento de [[1987]] serviria de base para cientistas interessados em compreender os mecanismos de sistemas de defesa adaptativas em [[bactéria]]s e [[archaea]], mas poucos anteciparam os impactos mais amplos de essas descobertas para novas aplicações na engenharia de genoma. Como as bactérias podem incorporar ADN exógeno em outras circunstâncias e até mesmo eliminar o DNA danificado de seu ambiente, CRISPR em um ambiente de laboratório para uma eventual utilização médica e não médica tornou-se uma idéia viável<ref>{{citar livro| vauthors = Overballe-Petersen S, Harms K, Orlando LA, Mayar JV, Rasmussen S, Dahl TW, Rosing MT, Poole AM, Sicheritz-Ponten T, Brunak S, Inselmann S, de Vries J, Wackernagel W, Pybus OG, Nielsen R, Johnsen PJ, Nielsen KM, Willerslev E | title = Bacterial natural transformation by highly fragmented and damaged DNA | journal = Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America | volume = 110 | issue = 49 | pages = 19860–5 | date = Dec 2013 | pmid = 24248361 | pmc =  | doi = 10.1073/pnas.1315278110 }}<br/>{{cite web|url=http://www.kurzweilai.net/bacteria-incorporate-pieces-of-old-dna-in-their-own-genome-scientists-discover |title=Bacteria incorporate pieces of old DNA in their own genome, scientists discover |doi=10.1073/pnas.1315278110 |publisher=KurzweilAI |accessdate=2013-11-26}}</ref>.  Há uma série de estudos publicados no início de 2000 discutindo a presença desses sistemas e investigando como eles funcionam<ref>[http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/11952905 Identification of genes that are associated with DNA repeats in prokaryotes.] por Jansen R, Embden JD, Gaastra W e Schouls LM. (Mol Microbiol. 2002 Mar;43(6):1565-75.)</ref>.
+No ano seguinte foi postulada a hipótese de que o CRISPR é um sistema de defesa adaptativo de bactérias e arqueias que faz uso de RNA antisenso como assinaturas de memória de invasões anteriores <ref>{{Citar periódico|titulo = A putative RNA-interference-based immune system in prokaryotes: computational analysis of the predicted enzymatic machinery, functional analogies with eukaryotic RNAi, and hypothetical mechanisms of action|url = http://www.biology-direct.com/content/1/1/7/abstract|jornal = Biology Direct|data = 2006-03-16|issn = 1745-6150|pmid = 16545108|paginas = 7|volume = 1|numero = 1|doi = 10.1186/1745-6150-1-7|idioma = en|primeiro = Kira S.|ultimo = Makarova|coautores = Nick V.}}</ref>. Esta proposta recebeu o suporte necessário quando foi evidenciada experimentalmente em S''treptococcus thermophilus'' <ref>{{Citar periódico|titulo = CRISPR Provides Acquired Resistance Against Viruses in Prokaryotes|url = http://www.sciencemag.org/content/315/5819/1709|jornal = Science|data = 2007-03-23|issn = 0036-8075|pmid = 17379808|paginas = 1709-1712|volume = 315|numero = 5819|doi = 10.1126/science.1138140|idioma = en|primeiro = Rodolphe|ultimo = Barrangou|coautores = Christophe}}</ref>, levando a sua primeira aplicação no campo da biotecnologia, a fim de imunizar bactérias utilizadas na indústria de laticínios contra infecção por bacteriófagos <ref>{{Citar periódico|titulo = CRISPR: New Horizons in Phage Resistance and Strain Identification|url = http://dx.doi.org/10.1146/annurev-food-022811-101134|jornal = Annual Review of Food Science and Technology|data = 2012-01-01|pmid = 22224556|paginas = 143-162|volume = 3|numero = 1|doi = 10.1146/annurev-food-022811-101134|primeiro = Rodolphe|ultimo = Barrangou|coautores = Philippe}}</ref>.
+Evidências obtidas em seguida mostraram que as sequências espaçadoras de DNA invasor intercaladas com os arranjos de repetições intrínsecas são transcritos em grandes moléculas de RNAs, e estas são cortadas em pedaços menores pela nuclease Cas9 auxiliada pelo tracrRNA, tornando-se crRNAs, que por sua vez formam complexos com as proteínas tipo Cas. O complexo age de forma a impedir a proliferação viral em bactérias, devido a capacidade de clivagem do DNA invasor pela Cas9, o complexo tracrRNA-crRNA tem um papel fundamental no direcionamento desta nuclease, tendo o DNA invasor como alvo <ref name=":5">{{Citar periódico|titulo = Virus Population Dynamics and Acquired Virus Resistance in Natural Microbial Communities|url = http://www.sciencemag.org/content/320/5879/1047|jornal = Science|data = 2008-05-23|issn = 0036-8075|pmid = 18497291|paginas = 1047-1050|volume = 320|numero = 5879|doi = 10.1126/science.1157358|idioma = en|primeiro = Anders F.|ultimo = Andersson|coautores = Jillian F.}}</ref><ref>{{Citar periódico|titulo = Small CRISPR RNAs Guide Antiviral Defense in Prokaryotes|url = http://www.sciencemag.org/content/321/5891/960|jornal = Science|data = 2008-08-15|issn = 0036-8075|pmid = 18703739|paginas = 960-964|volume = 321|numero = 5891|doi = 10.1126/science.1159689|idioma = en|primeiro = Stan J. J.|ultimo = Brouns|coautores = Matthijs M.}}</ref><ref>{{Citar periódico|titulo = CRISPR Interference Limits Horizontal Gene Transfer in Staphylococci by Targeting DNA|url = http://www.sciencemag.org/content/322/5909/1843|jornal = Science|data = 2008-12-19|issn = 0036-8075|pmid = 19095942|paginas = 1843-1845|volume = 322|numero = 5909|doi = 10.1126/science.1165771|idioma = en|primeiro = Luciano A.|ultimo = Marraffini|coautores = Erik J.}}</ref>. Nos últimos anos, estudos mostraram que aparentemente a Cas9 é a principal nuclease envolvida no processo de clivagem de DNA invasor <ref name=":6">{{Citar periódico|titulo = The CRISPR/Cas bacterial immune system cleaves bacteriophage and plasmid DNA|url = http://www.nature.com/doifinder/10.1038/nature09523|jornal = Nature|data = 2010-01-01|volume = 468|numero = 7320|doi = 10.1038/nature09523|primeiro = Josiane E.|ultimo = Garneau|coautores = Marie-Ève}}</ref><ref>{{Citar periódico|titulo = CRISPR RNA maturation by trans-encoded small RNA and host factor RNase III|url = http://www.nature.com/doifinder/10.1038/nature09886|jornal = Nature|data = 2011-01-01|pmid = 21455174|volume = 471|numero = 7340|doi = 10.1038/nature09886|primeiro = Elitza|ultimo = Deltcheva|coautores = Krzysztof}}</ref> dentre os vários tipos de Cas descritos,  algumas ainda precisam ter suas funções elucidadas.
+Em 2011, foi demonstrado que é possível transferir a memória imune de uma espécie de bactéria para outra, gerando novas possibilidades de aplicações do mecanismo <ref>{{Citar periódico|titulo = The Streptococcus thermophilus CRISPR/Cas system provides immunity in Escherichia coli|url = http://nar.oxfordjournals.org/content/39/21/9275|jornal = Nucleic Acids Research|data = 2011-11-01|issn = 0305-1048|pmid = 21813460|paginas = 9275-9282|volume = 39|numero = 21|doi = 10.1093/nar/gkr606|idioma = en|primeiro = Rimantas|ultimo = Sapranauskas|coautores = Giedrius}}</ref>, o que levou aos estudos que mostraram que Cas9 purificadas são capazes de clivar DNA alvo ''in vitro'' quando guiadas por crRNAs <ref>{{Citar periódico|titulo = A Programmable Dual-RNA–Guided DNA Endonuclease in Adaptive Bacterial Immunity|url = http://www.sciencemag.org/content/337/6096/816|jornal = Science|data = 2012-08-17|issn = 0036-8075|pmid = 22745249|paginas = 816-821|volume = 337|numero = 6096|doi = 10.1126/science.1225829|idioma = en|primeiro = Martin|ultimo = Jinek|coautores = Krzysztof}}</ref><ref>{{Citar periódico|titulo = Cas9–crRNA ribonucleoprotein complex mediates specific DNA cleavage for adaptive immunity in bacteria|url = http://www.pnas.org/content/109/39/E2579|jornal = Proceedings of the National Academy of Sciences|data = 2012-09-25|issn = 0027-8424|pmid = 22949671|paginas = E2579-E2586|volume = 109|numero = 39|doi = 10.1073/pnas.1208507109|idioma = en|primeiro = Giedrius|ultimo = Gasiunas|coautores = Rodolphe}}</ref>. O que resultou na utilização do sistema CRISPR como uma ferramenta de engenharia genética, tornando possível editar com sucesso o genoma de células de mamíferos, assim como de inúmeros outros sistemas modelos <ref name=":1" /><ref>{{Citar periódico|titulo = Highly efficient RNA-guided genome editing in human cells via delivery of purified Cas9 ribonucleoproteins|url = http://genome.cshlp.org/content/24/6/1012|jornal = Genome Research|data = 2014-06-01|issn = 1088-9051|pmid = 24696461|paginas = 1012-1019|volume = 24|numero = 6|doi = 10.1101/gr.171322.113|idioma = en|primeiro = Sojung|ultimo = Kim|coautores = Daesik}}</ref><ref>{{Citar periódico|titulo = Multiplex Genome Engineering Using CRISPR/Cas Systems|url = http://www.sciencemag.org/content/339/6121/819|jornal = Science|data = 2013-02-15|issn = 0036-8075|pmid = 23287718|paginas = 819-823|volume = 339|numero = 6121|doi = 10.1126/science.1231143|idioma = en|primeiro = Le|ultimo = Cong|coautores = F. Ann}}</ref>.
-A partir do ano [[2000]], repetições agrupamentos semelhantes foram identificadas em adicionais bactérias e [[archaea]] e foram denominadas "Repetições Curtas Regularmente Espaçadas" ({{langx|en|''"SRSR"''}})<ref name="pmid10760181">{{citar livro| vauthors = Mojica FJ, Díez-Villaseñor C, Soria E, Juez G | title = Biological significance of a family of regularly spaced repeats in the genomes of Archaea, Bacteria and mitochondria | journal = Molecular Microbiology | volume = 36 | issue = 1 | pages = 244–246 | date = Apr 2000 | pmid = 10760181 | doi = 10.1046/j.1365-2958.2000.01838.x }}</ref>. ''"SRSR"'' foi rebatizado como CRISPR em [[2002]]<ref name="pmid11952905">{{citar livro | vauthors = Jansen R, Embden JD, Gaastra W, Schouls LM | title = Identification of genes that are associated with DNA repeats in prokaryotes | journal = Molecular Microbiology | volume = 43 | issue = 6 | pages = 1565–1575 | date = Mar 2002 | pmid = 11952905 | doi = 10.1046/j.1365-2958.2002.02839.x }}</ref>.  Um conjunto de [[gene]]s, algumas [[proteína]]s [[nuclease]] ou [[Helicase| ADN helicase]] de codificação putativas{{notaNT|Um gene putativo é um segmento de ADN cuja proteína, e a sua função, não é conhecida, mas com base na sua estrutura de leitura aberta, acredita-se que seja um gene<ref>{{Cite book |last=Slonczewski |first=Joan |author2=John Watkins Foster  |title=Microbiology: An Evolving Science |location=New York |publisher=W.W. Norton & Co. |year=2009 |isbn=978-0-393-97857-5 |oclc=185042615}}</ref>.}}, foram encontradas sendo associadas com repetições CRISPR (CAS, ou genes associados a CRISPR)<ref name="pmid3316184">{{citar livro | vauthors = Ishino Y, Shinagawa H, Makino K, Amemura M, Nakata A | title = Nucleotide sequence of the iap gene, responsible for alkaline phosphatase isozyme conversion in Escherichia coli, and identification of the gene product | journal = Journal of Bacteriology | volume = 169 | issue = 12 | pages = 5429–5433 | date = Dec 1987 | pmid = 3316184 | pmc = 213968 }}</ref>.
+==Diversidade do Sistema==
+O ''locus'' CRISPR é composto por cerca de 20 a 50 pares de base, normalmente dispostos simetricamente, o que favorece a formação de uma estrutura em “grampo” ou “''hairpin''”. Neste ''locus'' são encontradas repetições separadas por protoespaçadores de tamanho similar, os quais podem ser adicionados rapidamente como parte da resposta imune bacteriana contra infecção ocasionada por fagos além de variar em tamanho e sequência <ref name=":0" /><ref name=":4" />.
+Têm sido descrito que dentre os 198 genomas completos disponíveis no banco de dados NCBI, é possível encontrar cerca de 50 genomas onde o gene Cas1 está presente <ref name=":4" />. Além disso, sabe-se que a grande maioria dos “protoespaçadores” possui homologia com genes conhecidos, frequentemente provenientes de elementos extra-cromossômicos tais como fagos e
-Os trabalhos dessa área estavam fazendo o que é chamado de ciência de base, ou a [[ciência fundamental]], investigando algo para o bem da curiosidade ou interesse - não porque eles sabiam que a investigação teria um resultado prático ou rentável<ref>[http://www.techinsider.io/the-people-who-discovered-the-most-powerful-genetic-engineering-tool-we-know-found-it-by-accident-2015-6 The researchers behind 'the biggest biotech discovery of the century' found it by accident] por Kevin Loria, em "Business Insider" (2015)</ref>. Entretanto, estas observações conduziram à hipótese de que CRISPR são componentes centrais de um sistema imunitário adaptativo,  e em [[2007]] Barrangou<ref>[http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1879625715000425#bib0295 CRISPR provides acquired resistance against viruses in prokaryotes] por R. Barrangou et al em "Science", 315 ([[2007]]), pp. 1709–1712 [http://www.sciencemag.org/content/315/5819/1709 DOI: 10.1126/science.1138140</ref> forneceu a primeira demonstração de imunidade adaptativa em bactérias através da monitorização loci CRISPR em [[Cultura bacteriana|culturas desafiados]] por fagos de [[Streptococcus thermophilus]]. Before CRISPR, a engenharia para uma mutação nas células era caro e trabalhoso. Era comum tese inteira de um aluno ser mudar um gene.
+plasmídeos <ref name=":4" />. Em ''Yersinia pestis'' estas repetições ocorrem preferencialmente pela absorção do DNA de bacteriófagos <ref name=":0" />.
+O primeiro estudo demonstrando como ocorre o direcionamento do complexo CRISPR/Cas9, de modo a permitir a ligação com a sequência complementar do gene alvo, e eliminação de um agente infeccioso em bactérias ocorreu em ''Streptococcus thermophilus'' em 2010 <ref name=":0" /><ref name=":6" />.
-Então, em [[2012]], foi publicada um artigo<ref>[ Science. [[2012]] agosto 17;337(6096):816-21. doi: 10.1126/science.1225829. Epub 2012 Jun 28.
-[http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22745249?dopt=Abstract&holding=npg A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity.] por Jinek M et al</ref> sobre esta nova técnica que iria permitir aos investigadores para alterar rapidamente o DNA de quase qualquer organismo - incluindo os seres humanos. Logo depois, vários pesquisador abandonaram suas abordagens anteriores à modelagem de doenças  e adoptaram este nova técnica. Dr. Bruce Conklin, um geneticista, disse que seu laboratório foi em seguida, febrilmente alterar genes associados a várias doenças cardíacas.
+Atualmente, sabe-se que este distinto sistema imune pode ser dividido em três tipos principais, baseado na conservação dos genes e organização dos ''loci'' (CRISPR Tipo I, Tipo II e Tipo III) <ref name=":7">{{Citar periódico|titulo = Evolution and classification of the CRISPR–Cas systems|url = http://www.nature.com/doifinder/10.1038/nrmicro2577|jornal = Nature Reviews Microbiology|data = 2011-01-01|pmid = 21552286|volume = 9|numero = 6|doi = 10.1038/nrmicro2577|primeiro = Kira S.|ultimo = Makarova|coautores = Daniel H.}}</ref>.
-Em 2012-2013, pesquisadores falavam que CRISPR estava causando uma grande reviravolta na investigação biomédica, tal como [[Reação em cadeia da polimerase|PCR]], o método de amplificação do gene que revolucionou engenharia genética após a sua invenção em 1985. Ao contrário de outros métodos de gene de edição, é barato, rápido e fácil de usar, e se propagou através de laboratórios ao redor do mundo como resultado. Os pesquisadores esperam usá-lo para ajustar genes humanos para eliminar doenças, criar plantas mais resistentes, limpe patógenos e muito mais<ref>[http://www.nature.com/news/crispr-the-disruptor-1.17673 CRISPR, the disruptor <small>A powerful gene-editing technology is the biggest game changer to hit biology since PCR. But with its huge potential come pressing concerns.</small>] por Heidi Ledford
-em [[3 de junho]] de [[2015]]</ref>. Por exemplo, em [[2014]], pesquisadores na [[China]] relataram o nascimento dos primeiros macacos via bio-engenharia usando mutações direcionadas<ref>[http://www.cell.com/cell/abstract/S0092-8674(14)00079-8?_returnURL=http%3A%2F%2Flinkinghub.elsevier.com%2Fretrieve%2Fpii%2FS0092867414000798%3Fshowall%3Dtrue Generation of Gene-Modified Cynomolgus Monkey via Cas9/RNA-Mediated Gene Targeting in One-Cell Embryos] - Volume 156, Issue 4, p836–843, 13 de fevereiro de 2014 ( Cell [http://dx.doi.org/10.1016/j.cell.2014.01.027 Niu, Y. et al.](2014).</ref> , uma conquista que poderia ser um trampolim para fazer modelos mais realistas de pesquisa de doenças humanas.
+Uma particularidade do sistema CRISPR Tipo I se dá pela presença de ao menos um gene que codifique a nuclease Cas3, a qual participa ativamente na clivagem de uma molécula de DNA invasor <ref name=":7" />.
-As tentativas anteriores para modificar geneticamente os primatas confiaram em métodos virais<ref>[http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/18488016?dopt=Abstract&holding=npg Towards a transgenic model of Huntington's disease in a non-human primate.]Yang, S.-H. et al. Nature 453, 921–924 (2008)</ref><ref>[http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/19478777?dopt=Abstract&holding=npg Generation of transgenic non-human primates with germline transmission]Sasaki, E. et al. Nature 459, 523–527 (2009).</ref>, que criam mutações de forma eficiente, mas em locais imprevisíveis e em números não controlados. Perspectivas para os primatas ficou ainda melhor com o surgimento do sistema gene [[Cas9]] de edição de CRISPR, que utiliza trechos de [[RNA]] personalizáveis para orientar a enzima de corte de DNA, Cas9, ao local mutação desejada<ref>[http://www.nature.com/news/first-monkeys-with-customized-mutations-born-1.14611 First monkeys with customized mutations born - Milestone for targeted gene-editing technology promises better models for human diseases.] por Helen Shen em 30 de janeiro de 2014</ref>.  Mas, embora CRISPR tenha muito a oferecer, alguns cientistas estão preocupados que o crescimento do campo em ritmo alucinante deixe pouco tempo para o atendimento das preocupações éticas e de segurança em experimentos podem aumentar. O problema foi empurrado no centro das atenções em abril de 2015, quando surgiram as notícias<ref>[http://www.nature.com/news/embryo-editing-sparks-epic-debate-1.17421  Embryo editing sparks epic debate <small>In wake of paper describing genetic modification of human embryos, scientists disagree about ethics.</small>] por David Cyranoski & Sara Reardon em 29 de abril de 2015</ref> de que cientistas haviam usado CRISPR para engenheiria embriões humanos<ref>[http://chemport.cas.org/cgi-bin/sdcgi?APP=ftslink&action=reflink&origin=npg&version=1.0&coi=1:CAS:528:DC%2BC2MXmslegt7Y%3D&pissn=0028-0836&md5=d7f2f7d930cee89a092dc38a6b58cb12 CRISPR/Cas9-mediated gene editing in human tripronuclear zygotes] por Liang em "Protein & Cell" (2015), 6(5), 363-372 CODEN: PCREFB; ISSN: 1674-800X.</ref>.
+O sistema CRISPR Tipo II é considerado o mais robusto para aquisição de plasmídeos e fagos. Nele são encontrados apenas quatro genes, dentre os quais sempre haverá ao menos um gene que codifique a nuclease Cas9, a qual pode participar tanto no processamento de RNA quanto na eliminação do DNA alvo <ref name=":3" /><ref name=":7" /><sup>.</sup>
-==Aplicação==
-Aplicações de CRISPR abrangem quase todos os setores envolvendo sistemas biológicos. Danisco <ref>[http://www.the-scientist.com/?articles.view/articleNo/41676/title/There-s-CRISPR-in-Your-Yogurt/ There’s CRISPR in Your Yogurt - We’ve all been eating food enhanced by the genome-editing tool for years.] por Kerry Grens em 1 de janeiro de 2015.</ref>.  Aplicações na [[agricultura]] têm obstáculos regulatórios mais baixos do que aplicação [[biomédica]] e alguns desses mercados estão previstos a produzir retornos sobre os investimentos muito rapidamente.  Dow AgroSciences co-desenvolveu propriedade intelectual com Sangamo Biosciences para o desenvolvimento de culturas geneticamente modificadas utilizando [[Cas9]], e Cellectis Ciências Vegetais está levando a tecnologia para as plantações<ref>[http://www.genengnews.com/insight-and-intelligence/gene-editing-will-change-everything-just-not-all-at-one-time/77900351/ Gene Editing Will Change Everything—Just Not All at One Time - Transformative technology is still in its infancy but great things are expected in human health and industrial and agbio markets.] por Harry Glorikian em "Genetic Engineering & Biotechnology News"</ref>. Da mesma forma, Recombinetics Inc.<ref>[https://innovativegenomics.org/crispr-workshop/ Innovative Genomics Initiative CRISPRWORKSHOP - ROUTES TO DESIGNER BIOLOGY] palestras entre 20 a 24 de julho de 2015</ref> está usando [[TALEN]]s.<ref name=Boch2011>{{cite journal|last=Boch|first=Jens|title=TALEs of genome targeting|journal=Nature Biotechnology|date=February 2011|volume=29|issue=2|pages=135–6|doi=10.1038/nbt.1767|pmid=21301438}}</ref>
-, [[ZFN]]s<ref name="kim1996">{{cite journal|last = Kim|first = YG|author2 = Cha, J.|author3 = Chandrasegaran, S.|year = 1996|title = Hybrid restriction enzymes: zinc finger fusions to Fok I cleavage domain|journal = Proc Natl Acad Sci USA|volume = 93|issue = 3|pages = 1156–60|url = http://www.pnas.org/content/93/3/1156.abstract|doi = 10.1073/pnas.93.3.1156|pmid = 8577732|pmc = 40048|bibcode = 1996PNAS...93.1156K}}</ref> e [[Cas9]] para aumentar a produtividade no setor da [[pecuária]]<ref>W. Tan, D.F. Carlson, C.A. Lancto, J.R. Garbe, D.A. Webster, P.B. Hackett, S.C. Fahrenkrug [http://www.pnas.org/content/110/41/16526.abstract Efficient nonmeiotic allele introgression in livestock using custom endonucleases] Proc Natl Acad Sci, 110 (2013), pp. 16526–16531</ref>.
+Uma peculiaridade pode ser observada no sistema CRISPR Tipo III, que foi subsequentemente dividido em dois subtipos. Tais sistemas foram denominados como CRISPR TipoIII-A, o qual é capaz de atuar sobre DNA plasmidial ''in vivo'', e CRISPR Tipo III-B responsável pela clivagem apenas de RNA fita simples ''in vitro''. Estas observações sugerem que seja possível a existência de diferentes mecanismos de atuação envolvendo subtipos distintos de CRISPR <ref name=":0" /><ref name=":7" />.
-Além da exploração agrícola, os investigadores estão considerando como CRISPR poderia ou deveria ser implantado em organismos em estado selvagem. Grande parte da atenção tem-se centrado no método chamado um gene-guia<ref>[http://www.nature.com/news/crispr-the-disruptor-1.17673#gene gene drive]</ref>, que pode varrer rapidamente um gene editado do meio de uma população. O trabalho está em um estágio inicial, mas tal técnica pode ser usada para acabar com os [[pernilongo]]s ou [[carrapato]]s transmissores de doenças, eliminar plantas invasoras ou erradicar a resistência a herbicidas em [[Amaranto|caruru]]<ref>[http://www.nature.com/news/crispr-the-disruptor-1.17673#b1 CRISPR, the disruptor]por Heidi Ledford em "Nature" (3 de Junho de 2015)</ref>.
+Vale ressaltar a possibilidade de encontrar mais de um sistema CRISPR em um mesmo organismo, o que claramente demonstra a compatibilidade entre estes sistemas, bem como a possibilidade de compartilhamento dos componentes funcionais presentes nos diferentes sistemas <ref name=":0" /><sup>.</sup>
-CRISPR tem o potencial para se tornar uma força importante na [[ecologia]] e [[Biodiversidade|conservação]], especialmente quando combinada com outras ferramentas de [[biologia molecular]]. Pode, por exemplo, ser utilizada para introduzir os genes que lentamente matam as mosquitos que espalham a [[malária]]. Ou os genes que colocam os freios na disseminação de espécies invasoras como ervas daninhas. Pode vir a ser o próximo grande salto na conservação ou melhoraria do meio ambiente e abrir toda uma nova [[Caixa de Pandora|caixa de riscos e recompensas]]<ref>[http://www.pbs.org/wgbh/nova/next/evolution/crispr-gene-drives/ Genetically Engineering Almost Anything] por Tim De Chant e Eleanor Nelsen pela PBS em [[17 de Julho]] de [[2014]]</ref>.
-Aplicações baseadas em [[Cas9]] na indústria agrícola e segmentos de mercado para [[Enzima de restrição|endonucleases]]{{notaNT|Endonucleases são [[enzima]]s que clivam a [[ligação fosfodiéster]] dentro de uma [[Polinucleótido|cadeia polinucleotídica]].<ref name="Cox_Nelson_Lehninger_2005">{{cite book | author = Cox M, Nelson DR, Lehninger AL | title = Lehninger principles of biochemistry | publisher = W.H. Freeman | location = San Francisco | year = 2005 | pages = 952  | isbn = 0-7167-4339-6 }}</ref>}} Cas9 dentro dos setores da saúde humana estão experimentando um crescimento frenético. Estes mercados incluem: [[Terapia genética|geneterapia]], [[terapia celular]] e [[imunoterapia]], o desenvolvimento rápido e eficiente de pesquisa de animais transgênicos, descoberta de medicamentos, bem como a validação de alvo e de triagem<ref>[http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1879625715000425 The history and market impact of CRISPR RNA-guided nucleases] por Paul BG van Erp, Gary Bloomer, Royce Wilkinson, Blake Wiedenheft1, et al (doi:10.1016/j.coviro.2015.03.011)</ref>.
+Recentemente, verificou-se a capacidade de fagos em promover mutações em seu genoma de modo a conseguir evadir a resposta imune bacteriana. Esta capacidade tem sido considerada o modelo básico de evolução CRISPR, uma vez que tais mutações impossibilitam a complementaridade do sistema tracRNA/crRNA com o fago e, portanto, impedem a associação com a nuclease Cas9 e a subsequente clivagem do DNA invasor <ref name=":5" /><ref>{{Citar periódico|titulo = CRISPR Immunity Drives Rapid Phage Genome Evolution in Streptococcus thermophilus|url = http://mbio.asm.org/content/6/2/e00262-15|jornal = mBio|data = 2015-05-01|issn = 2150-7511|pmid = 25900652|paginas = e00262-15|volume = 6|numero = 2|doi = 10.1128/mBio.00262-15|idioma = en|primeiro = David|ultimo = Paez-Espino|coautores = Itai}}</ref>.
-===Terapêutica===
-Ao longo dos últimos anos, o sistema CRISPR-cas teve pequenos problemas para a sua utilização terapêutica potencial em terapia génica, com o CRISPR de ARN identificando o alvo da parte relevante de ADN e a proteína Cas clivando. No entanto, o grande problema era o fato de que, para Cas9 para ser eficaz, deveria primeiro ser capaz de [[Parede celular|entrar nas células-alvo]] de forma eficiente. Desde de 2015, uma equipe de pesquisadores da [[Carolina do Norte]] criou e utiliza um [[Nanoclew|veículo em nanoescala composto de ADN]] para entregar o complexo edição CRISPR-Cas9 em células tanto [[in vitro]] e [[in vivo]]. Quando o [[nanoclew]] entra em contato com uma [[célula]], a célula absorve o nanoclew completamente através de mecanismos típicos de [[endocitose]]. Os nanoclews são revestidos com um [[polímero]] carregado positivamente, com o fim de quebrar a [[Endossomo|membrana endossomal]] e libertar nanoclew no interior da célula. O complexos CRISPR-Cas9, em seguida, libertam-se da estrutura de ADN para abrir caminho para o núcleo. Uma vez que o complexo CRISPR-Cas9 atinge o núcleo, então, a edição do gene pode começar<ref>[http://www.genengnews.com/gen-news-highlights/threading-the-crispr-needle-with-dna-nanoclews/81251680/ Threading the CRISPR Needle with DNA Nanoclews] publicado na "GEN News" em [[31 de agosto]] de [[2015]]</ref>.
+==Mecanismo de Atuação da CRISPR==
-Editas Medicina foi fundada com o objetivo de desenvolver tratamentos que empregam CRISPR/[[Cas9]] para fazer edições em pares de bases individuais e grandes segmentos de ADN. A empresa planeja usar CRISPR para coletar de [[Hemocitoblasto|células-tronco hematopoiéticas]] da [[medula óssea]] do paciente, corrigindo um ou mais genes defeituosos com CRISPR, e depois retornando as células a medula do paciente, que passaria então a produzir [[glóbulos vermelhos]] saudáveis. O seu objetivo para o tratamento de [[fibrose cística]] e [[Anemia falciforme|anemia pela formação de células falciformes]], cada um dos quais são causados por mutações de par de bases individual<ref name=tr1311>{{cite web|last=Young |first=Susan |url=http://www.technologyreview.com/news/522051/new-genome-editing-method-could-make-gene-therapy-more-precise-and-effective/ |title=Biotech Startup Editas Medicine Wants to Cure Grievous Genetic Diseases with New Genome Editing Technology &#124; MIT Technology Review |publisher=Technologyreview.com |accessdate=[[2015]]}}</ref>.   Dr. Bence Gyorgy, juntamente está trabalhando com [[Cobaia|cobaias]], em um esforço para desenvolver abordagens baseadas CRISPR para tratar a [[doença de Alzheimer]] e para corrigir a forma genética de [[surdez]]. Por volta de agosto de 2015, a tecnologia era mais adequado para a destruição de versões de genes "maus" que causam a doença, mas os cientistas esperam aque por volta de [[2017]], também será capaz de substituir essas versões normais com cópias saudáveis do gene<ref>[ Could the DNA-editing CRISPR revolutionize medicine?] por Carina Storrs ([[CNN]]) em [[12 de agosto]] de [[2015]]</ref>.
+De maneira geral, todos os mecanismos CRISPR expressam as mesmas vias de aquisição, expressão e interferência, conforme descrito a seguir <ref name=":7" />:
+'''a)     ''Aquisição de novos protoespaçadores:''''' Geralmente realizada através do reconhecimento e clivagem de ácidos nucleicos exógenos mediados por Cas1 e Cas2 para sua integração ao cromossomo bacteriano em regiões conhecidas como ''locus'' CRISPR <ref name=":7" />.
-Em agosto de 2015, pesquisadores da Harvard e do MIT descobriram que o "gene da [[obesidade]]" liga a dois outros genes que impedem gordura a ser queimada na forma de calor - um processo chamado [[termogênese]]<ref>[http://www.telegraph.co.uk/news/health/news/11812324/Have-scientists-at-Harvard-and-MIT-found-a-cure-for-obesity.html Ha ve scientists at Harvard and MIT found a cure for obesity?] por Sarah Knapton em [[20 de agosto]] de [[2015]] (The Telegraph)</ref>. O estudo revelou que certas variantes no gene FTO fabrica [[Adipócito|células adiposas]] de pessoa menos susceptíveis de se tornarem do tipo que queimam energia, e mais provável que seja o tipo que a armazenam como gordura. Anteriormente pensava-se o gene estava relacionado com a obesidade através de efeitos sobre o [[cérebro]] relativos ao apetite e a propensão para o exercício. Mas os pesquisadores descobriram que as variantes na verdade amplificam a atividade de outros dois genes - IRX3 e IRX5 - que estão envolvidos em determinar que tipo de células de gordura são produzidas<ref>[ Genetic switch directs fat cells to burn energy] em [[24 de agosto]] de [[2015]] por James Heather</ref>. Os pesquisadores demonstraram que é possível desativar esses genes utilizando a técnica de CRISPR que corta fora o código de DNA "ruim" e o substitui pela seqüência correta<ref>[http://sanfrancisco.cbslocal.com/2015/08/26/discovery-of-genetic-switch-fto-gene-that-turns-off-fat-cells-could-lead-to-a-cure-for-obesity/ A Cure For Obesity? Scientists Discover Genetic Switch That Turns Off Fat Cells] em [[26 de agosto]] de [[2015]] na CBS - San Francisco</ref>.  Em testes, cientistas já foram capazes de reverter problemas genéticos que resultam em [[cegueira]], puderam parar o avanço de células cancerígenas e até mesmo criaram organismos imunes ao vírus [[HIV]]<ref>[http://exame.abril.com.br/tecnologia/noticias/financiada-por-bill-gates-startup-pode-revolucionar-saude Financiada por Bill Gates, startup pode revolucionar saúde] por Victor Caputo na revista Exame</ref>. Também em agosto, os pesquisadores conseguiram explicar como uma variante de gene promotor de [[obesidade]] induz que algumas pessoas engordarem. Usando a ferramenta CRISPR, eles identificaram um [[Terapia genética|interruptor genético]] que ajuda a governar o metabolismo do corpo. Os interruptores controlam se das células de gordura comuns queimam a energia, em vez de armazená-la como gordura<ref>[http://news.sciencemag.org/biology/2015/08/identifying-gene-switch-turns-fat-cells-bad Identifying the gene switch that turns fat cells bad] por Gretchen Vogel em [[19 de agosto]] de [[2015]]</ref>.
+'''b)    ''Transcrição completa do locus CRISPR como um pre-crRNA:''''' Processamento e amadurecimento do transcrito em pequenas moléculas de RNA (crRNA) capazes de reconhecer uma única sequencia alvo <ref name=":7" />.
-===Lacticínios===
-Danisco ([[DuPont]]) foi um dos pioneiros na utilização comercial da tecnologia CRISPR para aumentar a imunidade viral em bactérias utilizadas para fazer [[iogurte]]s e [[queijo]], mas outros mercados vêm emergindo rapidamente<ref>[http://www.the-scientist.com/?articles.view/articleNo/41676/title/There-s-CRISPR-in-Your-Yogurt/ There’s CRISPR in Your Yogurt - We’ve all been eating food enhanced by the genome-editing tool for years.] por Kerry Grens em 1 de janeiro de 2015.</ref>. DuPont utiliza CRISPR para desenvolver culturas naturais com uma estrutura interna de imunidade aos fagos que geralmente atacam durante a produção de queijo. Ao contrário das culturas utilizadas para rotações convencionais em fábricas lácteos fermentados, "CHOOZIT<ref>[http://www.danisco.com/product-range/cultures/choozittm-cheese-cultures/ CHOOZIT™ Cheese Cultures] - A comprehensive range of products for controlled acidification and for emphasizing and diversifying flavor profiles.</ref>" são caracterizados pela suas idênticas funcionalidade permitindo que cada membro da rotação execute exatamente da mesma maneira. A única diferença reside na sua imunidade a fagos. Os principais benefícios incluem melhorias de produtividade, otimização de tempo de processo e minimização de "downgrades" de produtos, graças a inovação técnica CRISPR que permite a rotação de culturas, sem variabilidade indesejada<ref>[http://www.danisco.com/about-dupont/news/news-archive/2012/dupont-hurdles-the-process-challenges-for-pizza-cheese/ DuPont Nutrition & Health Hurdles the Process Challenges for Pizza Cheese] por Richard Donavan</ref>.
-===Pecuária===
-Dr. Scott Fahrenkrug de Recombinetics anunciou, em julho de 2015, que desenvolveu uma maneira de editar os genes de animais para mudar traços específicos, tanto para usos agrícolas e biomédicos. Ele desenvolveu uma forma de editar os genes de animais de fazenda para alterar características específicas. Ele podem editar o traço que faz crescer chifres no gado. Isso significa que uma vaca não nasce com chifres, e nunca precisa se submeter ao processo sangrento de descorna. Usando o método CRISPR, os investigadores podem fazer que uma parte pequena do genoma do gado leiteiro assemelhar-se o genoma de sem chifres gado [[Red Angus]]. Isso significa que eles podem remover seus chifres sem fazer quaisquer outras alterações genéticas<ref>[http://www.techinsider.io/why-animal-rights-activists-should-love-genetically-edited-animals-2015-7#ixzz3kFOzLAzA Why animal rights activists should love genetically edited animals] por Kevin Loria em [[28 de julho]] de [[2015]]</ref>. Um outro exemplo do uso de CRISPR para para mudar traços específicos é o caso do trabalho com células musculares em porcos. Os [[bovinos]] [[Belga Azul]] são enormes e fortes animais que fornecem excepcionalmente grandes quantidades de valorizado, cortes magros de carne, resultado de décadas de cruzamentos seletivos, porém, uma equipe de cientistas da [[China]], através da edição de um único gene criaram o equivalente [[suíno]] utilizando o método TALENs de edição genética<ref>[http://journals.plos.org/plosone/article?id=10.1371/journal.pone.0136690 Efficient Generation of Myostatin Knock-Out Sheep Using CRISPR/Cas9 Technology and Microinjection into Zygotes] por M. Crispo, et al. Publicado em [[25 de agosto]] de [[2015]] em "PLOS ONE" (DOI: 10.1371/journal.pone.0136690)</ref> que, muito mais rapidamente, introduz uma mutação no gene da [[miostatina]] em células fetais de porco que faz com que células musculares se multiplicarem<ref>[http://www.nature.com/news/super-muscly-pigs-created-by-small-genetic-tweak-1.17874 Super-muscly pigs created by small genetic tweak - Researchers hope the genetically engineered animals will speed past regulators.] por David Cyranoski em 30 de Junho de 2015.</ref>
+'''c)     ''Associação com proteínas Cas:''''' Formação de complexo ribonuclear capaz de guiar nucleases de maneira especifica em direção ao DNA alvo presente em bacteriofagos e plasmídeos <ref name=":7" />.
-===Método de pesquisa===
-Esta tecnologia também permite aos cientistas pintar um [[cromossomo]] inteiro e olhá-lo ao vivo e realmente segui-lo no [[Núcleo celular|núcleo]] durante o ciclo celular ou como ele passa por [[Embriogénese|transições de desenvolvimento]], por exemplo, em um [[embrião]], para ver como ele muda de tamanho e estrutura. O processo, que os cientistas se referem como "CRISPR-EATING" é relatado em um artigo<ref>[http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1534580715004864 CRISPR EATING on a Low Budget] por Hatice S. Kaya-Okur e Andrew S. Belmont em "Developmental Cell" Volume 34, Ed. 3, [[10 de agosto]] de [[2015]], Pag. 253–254 [http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1534580715004864 doi:10.1016/j.devcel.2015.07.013]</ref> da revista "Developmental Cell", que mostra, como prova de princípio, que os pesquisadores transformaram o [[genoma]] inteiro de uma bactéria comum do intestino [[E. coli]] para uma biblioteca de 40.000 guias de [[ARN]] que cobriam 88 por cento do genoma bacteriano<ref>[http://news.berkeley.edu/2015/07/23/simple-technology-makes-crispr-gene-editing-cheaper/ Simple technology makes CRISPR gene editing cheaper] por Robert Sanders publicado em [[23 de julho]] de [[2015]] na "Berkeley News"</ref>.
+'''3.1. <u>AQUISIÇÃO DE PROTOESPAÇADORES</u>'''
-Pesquisadores chineses relataram a edição os genomas de embriões humanos. Os resultados, que estão publicados<ref>[http://link.springer.com/article/10.1007%2Fs13238-015-0153-5 CRISPR/Cas9-mediated gene editing in human tripronuclear zygotes] por Puping Liang, Yanwen Xu, Xiya Zhang, Chenhui Ding, Rui Huang, Zhen Zhang, Jie Lv, Xiaowei Xie, Yuxi Chen, Yujing Li, at al (DOI: 10.1007/s13238-015-0153-5)em 18 de abril de 2015.</ref> na revista "Protein on-line & Cell", demonstraram um número surpreendente de mutações "fora de alvo<ref>[http://dharmacon.gelifesciences.com/uploadedFiles/Resources/off-target-tech-review-technote.pdf Off-target Effects: Disturbing the Silence of RNA interference (RNAi)] Dharmacon™-RNAi, Gene Expression & Gene Editing</ref>" que se presume serem introduzidas pelo complexo CRISPR/Cas9 atuando em outras partes do genoma. Este efeito é uma das principais preocupações de segurança que rodeiam edição da linha [[Célula germinativa|germinal]]do gene, porque estas mutações não intencionais podiam ser prejudiciais. As taxas de tais mutações foram muito superiores do que as observados em gene de edição de embriões de ratos ou células adultas humanas e confirmam rumores de que tais experimentos foram conduzidos<ref>Lanphier, E. et al. [http://www.nature.com/news/don-t-edit-the-human-germ-line-1.17111 Nature 519]], 410–411 (2015)</ref><ref>Baltimore, D. et al. Science 348, 36–38 (2015).</ref>. Isto provocou um debate, em abril de [[2015]], sobre as implicações éticas de tal trabalho<ref>[http://www.nature.com/news/chinese-scientists-genetically-modify-human-embryos-1.17378 Chinese scientists genetically modify human embryos - Rumours of germline modification prove true] por David Cyranoski & Sara Reardon em [[22 de april]] de [[2015]] pela "Nature Publishing Group"</ref>.
+A integração de uma nova informação nos ''loci'' CRISPR inicia-se pela imunidade bacteriana mediada por esse sistema, onde uma pequena porção do DNA invasor, é integrada ao ''locus'' CRISPR do hospedeiro como um protoespaçador através da atuação de nucleases específicas <ref name=":0" />.
-Em setembro de 2015, pesquisadores da [[Universidade de Harvard]] e do [[MIT|Instituto de Tec. de Massachusetts]] desenvolveram uma nova abordagem que permite aos pesquisadores conseguir o uso de duas variantes da proteína Cas9 para executar qualquer passos de tarefas edição ou regulação do gene usando um único Cas9 isoforme. A equipe de Harvard-MIT descobriu que o comprimento da sequência de ARN guia desempenha um papel fundamental na determinação do destino de Cas9, se ele apenas se liga ao ADN ou se extirpa o ARN também.  Este novo método CRISPR também pode ser utilizado na produção metabólica em grande escala de produtos químicos e combustíveis utilizando bactérias geneticamente modificadas, simultaneamente salvaguardando as biofábricas microbianas de infecção por agentes [[patogênico]]s estranhos<ref>[http://www.genengnews.com/gen-news-highlights/crispr-a-new-study-in-duality/81251703/ CRISPR: A New Study in Duality] publicado pela "GEN News" em [[8 de setembro]] de [[2015]].</ref>.
+Devido à alta afinidade encontrada entre a nucleasse  Cas1 e ácidos nucléicos, tem sido sugerido que esta enzima possua papel significativo no que se refere a integração e aquisição de novos protoespaçadores. Além disso, a ausência de necessidade de uma sequencia especifica de nucleotídeos para o acontecimento deste tipo de ligação com a Cas1 reforça esta idéia, uma vez que esta poderia atuar sobre qualquer seqüência protoespaçadora presente no genoma viral <ref name=":0" />.
-Pesquisadores do Hospital de Câncer Infantil de Boston acreditam que as mudanças de um pequeno pedaço de ADN na região intensificadora do gene [[BCL11A|Linfoma/leucemia 11A de células B]] pode contornar o [[Anomalia genética|defeito genético]] que é subjacente á [[Anemia falciforme|doença de células falciformes]] e possivelmente outras doenças do sangue como a [[talassemia]]<ref>[http://www.nature.com/nature/journal/vaop/ncurrent/full/nature15521.html BCL11A enhancer dissection by Cas9-mediated in situ saturating mutagenesis] por Matthew C. Canver, et al em "Nature" (2015) doi:10.1038/nature15521</ref>. Numa tentativa de imitar e melhorar as variações naturais, os investigadores desenvolveram ferramentas de edição de genes à base de CRISPR para cortar sistematicamente pequenas as seções de ADN passo-a-passo ao longo de todo o comprimento do intensificador em [[Célula-tronco|células estaminais]] do sangue a partir de doadores humanos. A equipe em seguida deixou as células amadurecerem para [[Hemácia|células vermelhas do sangue]] e descobriram que a quantidade de [[Hemoglobina#Tipos de Hemoglobina|hemoglobina fetal]] das células produzidas tinham aumentado drasticamente. Além disso, os cientistas descobriram um local específico no intensificador que, quando o cortado, conduz à produção de níveis elevados de hemoglobina fetal<ref>[http://www.genengnews.com/gen-news-highlights/crispr-exploits-vulnerability-of-sickle-cell-disease/81251740/ CRISPR Exploits Vulnerability of Sickle Cell Disease] na "Genetic Engineering & Biotechnology News" em [[17 de setembro]] de [[2015]]</ref>.
+Outro ponto importante a ser destacado no que diz respeito a aquisição de novos protoespaçadores é a importância da manutenção da estrutura do ''locus''. Desta forma, seguida da adição de um novo protoespaçador, uma nova sequencia de repetição CRISPR é sintetizada favorecendo a organização “''repeat-spacer-repeat''”, essencial para o reconhecimento do ''locus'' CRISPR <ref name=":0" />.<gallery>
-== Ética e ações regulatórias==
+Estrutura do locus CRISPR
-[[imagem:Rebecca Daniels - Paducah (7450130714).jpg|thumb|right|150px|Membro da equipe de suporte responsável pela limpeza de incidentes químicos e biológicos.]]
+</gallery>A organização do ''locus'' CRISPR tem sido sugerida como ferramenta de grande valia para a distinção entre um DNA invasor e o do genoma hospedeiro pela maquinaria de reparo celular. Além disso, há relatos de que a seqüência líder possua elementos capazes de promover o recrutamento deste mecanismo de reparo celular de modo a favorecer a integração do protoespaçador no DNA bacteriano <ref name=":0" />.
-Em abril de [[2015]], quando os cientistas na [[China]] relataram a realização do primeiro experimento usando a edição CRISPR de genomas para alterar o DNA de embriões humanos, potencialmente afetando a linha germinal<ref> Liang P. ([[2015]]) ;6(5):363-72. doi: 10.1007/s13238-015-0153-5. Epub [[18 de abril]] de [[2015]] - [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/25894090?dopt=Abstract&holding=npg CRISPR/Cas9-mediated gene editing in human tripronuclear zygotes.]</ref>, inflamou ainda mais o protestos de cientistas que advertem que tal passo, atravessou uma linha [[ética]]<ref>[http://www.geneticliteracyproject.org/2015/06/25/ethical-and-regulatory-reflections-on-crispr-gene-editing-revolution/ Ethical and regulatory reflections on CRISPR gene editing revolution] por Jon Entine em [[25 de julho]] de [[2015]] - "Genetic Literacy Project"</ref>. Este anúncio tocou os sinos de alarme éticos, não apenas religiosos obcecados e transgênicos cautelares<ref>[http://www.independent.co.uk/news/science/scientists-sound-alarm-over-supercharged-gm-organisms-which-could-spread-in-the-wild-and-cause-environmental-disasters-10434010.html 'Gene drive': Scientists sound alarm over supercharged GM organisms which could spread in the wild and cause environmental disasters] por Steve Connor na "The Independent" em [[2 de agosto]] de [[2015]]</ref>, mas de um grupo de 18 proeminentes cientistas e especialistas em direito e ética que publicou uma carta <ref>[http://www.thedailybeast.com/articles/2015/03/30/new-dna-tech-creating-unicorns-and-curing-cancer-for-real.html New DNA Tech: Creating Unicorns and Curing Cancer for Real?] por David Duncan (30-3-2015 no BRAVE NEW WORLD)</ref> pedindo uma moratória sobre alguns usos dessa tecnologia.
+Os sinais moleculares envolvidos neste processo de distinção ainda não estão completamente elucidados. Contudo, o mapeamento das seqüências espaçadoras presentes nos genomas virais revelam uma seqüência de poucos nucleotídeos de comprimento próxima ao protoespaçador, denominada Motivo Adjacente ao Protoespaçador (''Protospacer Adjacent Motif'' - PAM) <ref name=":4" /><ref>{{Citar periódico|titulo = Protospacer Adjacent Motif (PAM)-Distal Sequences Engage CRISPR Cas9 DNA Target Cleavage|url = http://dx.doi.org/10.1371/journal.pone.0109213|jornal = PLoS ONE|data = 2014-10-02|pmid = 25275497|paginas = e109213|volume = 9|numero = 10|doi = 10.1371/journal.pone.0109213|primeiro = Regina|ultimo = Cencic|coautores = Hisashi}}</ref>.
-Os cientistas afirmam que a técnica de edição CRISPR pode modificar os genomas dos seres humanos e outras espécies de uma forma que poderia ter "efeitos imprevisíveis sobre as gerações futuras<ref>[http://chemport.cas.org/cgi-bin/sdcgi?APP=cp_scifinder&SERVICE=STN&CLI=scifinder&SID=819474-0147301386-103&FID=REDISPLAY&LANG=english&R=212429&DLP-REFERER=&DLP=1 Don't edit the human germ line] por Lanphier, et al publicado na "Nature" - [[Londres]]([[2015]]), 519(7544), 410-411 CODEN: NATUAS; ISSN: 0028-0836.</ref>" e "implicações profundas para a nossa relação com a natureza"<ref>[http://blogs.scientificamerican.com/guest-blog/gene-drives-and-crispr-could-revolutionize-ecosystem-management/ "Gene Drives" And CRISPR Could Revolutionize Ecosystem Management] por Kevin Esvelt, George Church e Jeantine Lunshof em [[17 de julho]] de [[2014]] na "Scientific American"</ref>. Mas os cientistas também querem controlar os termos das pesquisas. A "National Academies" nos [[Estados Unidos]], por exemplo, diz que vai "guiar a tomada de decisões" por convocação de pesquisadores e outros especialistas ainda em [[2015]] "para explorar as questões científicas, [[ética]]s e [[política]]s associadas com a edição e investigação do genoma humano". Os cientistas também enfatizam a necessidade de mais pesquisas sobre riscos e benefícios para a "melhor informar futuras conversas públicas". Os cientistas acreditam que um processo verdadeiramente deliberativo que é distribuído geograficamente e demograficamente inclusivo, pode revelar as variações na forma como os riscos são selecionados e priorizados em diferentes lugares e culturas do mundo. Valores, regimes de governança e agendas de investigação podem co-evoluir em resposta a técnica de edição CRISPR<ref>[http://www.nature.com/news/crispr-science-can-t-solve-it-1.17806 CRISPR: Science can't solve it] por Daniel Sarewitz em [[23 de junho]] de [[2015]] em "Nature"</ref>.
+Cada domínio PAM pode ter a sequência variável de acordo com o tipo de sistema CRISPR, sugerindo que proteínas Cas presentes nos distintos tipos de CRISPR estejam envolvidas no reconhecimento do domínio PAM <ref name=":0" /><ref name=":3" /><ref name=":8">{{Citar periódico|titulo = Development and Applications of CRISPR-Cas9 for Genome Engineering|url = http://www.cell.com/article/S0092867414006047/abstract|jornal = Cell|data = 2014-05-06|issn = 0092-8674|pmid = 24906146|paginas = 1262-1278|volume = 157|numero = 6|doi = 10.1016/j.cell.2014.05.010|idioma = English|primeiro = Patrick D.|ultimo = Hsu|coautores = Eric S.}}</ref>.
-Para o [[psicólogo]] e [[linguista]], Steven Pinker acredita que "''as preocupações são um exagero grosseiro''" . Ele diz que CRISPR é fundamental para reduzir o sofrimento humano, e escreveu os bioeticistas deve se esforçar para "''sair do caminho''" do progresso<ref>[http://www.bostonglobe.com/opinion/2015/07/31/the-moral-imperative-for-bioethics/JmEkoyzlTAu9oQV76JrK9N/story.html The moral imperative for bioethics] por Steven Pinker em [[1 de agosto]] de [[2015]] no jornal "The Boston Globe"</ref>. O professor, David Lemberg, editor da revista "Bioethics Today" ataca a postura do Dr. Pinker. Ele acredita que CRISPR ainda está em seus primeiros dias, mas isso é mais uma razão para pensar sobre a ética agora, e afirma que os investigadores razoáveis devem proceder com a máxima cautela, pois, lidar com os danos que possam surgir [como Pinker sugere] é reativo, não proativa. "''O papel dos bioeticistas, e de todas as partes que representam vários grupos de interesse, são para supervisionar tais pesquisas e limitar a sua conduta baseada no princípio da precaução''", diz Lemberg. "''Só porque nós podemos fazer uma coisa não significa que devemos fazer a coisa''"<ref>[http://www.popsci.com/should-bioethicists-get-out-way-crispr-research Should Bioethicists “Get Out Of The Way” Of CRISPR Research? - <small>Steven Pinker claims that will speed up progress</small>] por Alexandra Ossola publicado em [[6 de agosto]] de [[2015]] na revista "Popular Science".</ref>.
+'''3.2. <u>TRANSCRIÇÃO DO ''Locus'' CRISPR</u>'''
-A rede internacional de 22 cientistas e especialistas em ética do [http://www.hinxtongroup.org/|Grupo Hinxton] anunciaram em setembro de 2015 que a edição gene durante o estágio inicial do desenvolvimento embrionário, de fato, fornece "''um tremendo valor''" à investigação científica que poderia ter aplicações imensamente práticas no futuro<ref>[http://www.piercepioneer.com/gene-editing-possibilities-still-up-for-debate/46363 Gene Editing Possibilities Still Up for a Debate] por Silvia Fernandez em 11 de sep. de 2015</ref>. No entanto, Emmanuelle Charpentier, uma das cientistas por trás do desenvolvimento da técnica CRISPR/Cas9, disse: "''Pessoalmente, eu não acho que isso é aceitável manipular a linha germinal humana para o propósito de mudar alguns traços genéticos que serão transmitidos ao longo de gerações.''"<ref>[http://www.thenational.scot/news/edinburgh-university-expert-calls-for-approval-of-embryo-work.7438 Edinburgh University expert calls for approval of embryo work] publicado em 11 de setembro de 2015 por Greg Russell</ref>.
+'''3.2.1.      Tipo I'''
-Independente da controvérsia, em setembro de 2015, cientistas do Instituto Francis Crick pediram ao órgão regulador do [[Reino Unido]] de tratamento e pesquisa de fertilidade, para obter uma licença<ref>[http://www.biopharma-reporter.com/Markets-Regulations/UK-asks-to-use-CRISPR-on-human-embryos UK asks to use CRISPR on human embryos] por Fiona Barry em [[22 de setembro]] de [[2015]] em "William Reed Business Media"</ref>  para conduzir edição de gene CRISPR-Cas9 em embriões para um estudo de investigação sobre por que algumas mulheres têm [[aborto espontâneo]]<ref>[https://www.genomeweb.com/regulatory-news/uk-scientists-apply-permission-edit-embryos-crisprcas9-miscarriage-study UK Scientists Apply for Permission to Edit Embryos With CRISPR/Cas9 in Miscarriage Study] em [[18 de setembro]] de [[2015]] pela "GenomeWeb"</ref>.
+O sistema CRISPR Tipo I pode ser dividido em 6 subtipos categorizados de A a F. Neste sistema, a transcrição do ''locus'' CRISPR é seguida pela dobragem sobre si mesma das sequências repetidas para formar estruturas em grampo (''hairpins'') entre os protoespaçadores, seguida da clivagem do transcrito mediada pela nuclease Cas6e/f originando crRNA <ref name=":9">{{Citar periódico|titulo = Structural basis for CRISPR RNA-guided DNA recognition by Cascade|url = http://www.nature.com/doifinder/10.1038/nsmb.2019|jornal = Nature Structural & Molecular Biology|data = 2011-01-01|volume = 18|numero = 5|doi = 10.1038/nsmb.2019|primeiro = Matthijs M|ultimo = Jore|coautores = Magnus}}</ref>. Um complexo efetor conhecido como Cascade (Complexo associado a CRISPR para defesa antiviral) reúne cinco proteínas Cas <ref name=":9" /><ref>{{citar periódico|ultimo = Wiedenheft|primeiro = Blake|titulo = Structures of the RNA-guided surveillance complex from a bacterial immune system|jornal = NATURE|doi = 10.1038/nature10402|url = http://www.nature.com/nature/journal/v477/n7365/full/nature10402.html|acessadoem = }}</ref> ligadas ao crRNA. Este complexo é direcionado à sequência apropriada presente no DNA invasor por meio de reconhecimento do domínio PAM na fita complementar do crRNA <ref>{{Citar periódico|titulo = CRISPR|url = https://en.wikipedia.org/w/index.php?title=CRISPR&oldid=683090408|idioma = en}}</ref>. Uma vez que a identificação da sequência tenha sido estabelecida, uma mudança conformacional em Cascade recruta Cas3, a qual cliva o ácido nucleico invasor de modo sequência-específica <ref name=":9" />.
-==Patente==
-Em abril de [[2014]], uma patente<ref>[http://patft.uspto.gov/netacgi/nph-Parser?Sect1=PTO2&Sect2=HITOFF&p=1&u=%2Fnetahtml%2FPTO%2Fsearch-bool.html&r=1&f=G&l=50&co1=AND&d=PTXT&s1=8,697,359.PN.&OS=PN/8,697,359&RS=PN/8,697,359 CRISPR-Cas systems and methods for altering expression of gene products] United States Patent - 8 697 359 (15 de abril de 2014)</ref> aberta, nos [[Estados Unidos|EUA]], foi atribuída a [[Feng Zhang]], um cientista do Instituto "Broad" [[MIT]]-[[Harvard]] que afirma ter descoberto a eficácia das CRISPR-[[Cas9]] na edição de genes em células humanas. Zhang apresentou sua patente com a data de prioridade de dezembro de 2012<ref>[http://overlawyered.com/2015/08/the-race-to-patent-crispr/ The race to patent Crispr] por Walter Olson em [[12 de agosto]] de [[2015]]</ref>. Apenas alguns meses mais tarde, o [[Breakthrough Prize in Life Sciences|prêmio "Breakthrough"]] foi atribuído a J. Doudna e E. Charpentier pela contribuição para a descoberta de CRISPR. Doudner e Charpentier registraram uma patente<ref>[http://www.google.com/patents/US20140068797?cl=en Methods and compositions for rna-directed target dna modification and for rna-directed modulation of transcription] Pat: US 20140068797 A1 (May 25, 2012)</ref> com a data de prioridade de [[25 de maio]] de [[2012]], que inclui 155 reivindicações, englobando inúmeras aplicações do sistema para uma variedade de tipos de células.
+'''3.2.2.      Tipo II'''
-Todas as partes nesta disputa fundaram empresas de biotecnologia na corrida para desenvolver CRISPR como medicamento clínico viável. Zhang co-fundou Editas Medicine com Doudner<ref>[http://editasmedicine.com/about-founders.php Editas]</ref> antes desistir e vir a fundar Caribou Biosciences e Intellia Therapeutics<ref>[http://www.marketwatch.com/story/intellia-therapeutics-announces-15-million-in-funding-to-develop-therapeutic-products-utilizing-crispr-cas9-gene-editing-technology-2014-11-18 Intellia Therapeutics Announces $15 Million in Funding to Develop Therapeutic Products Utilizing CRISPR-Cas9 Gene Editing Technology] publicado em [[18 de novembro]] de [[2014]] por Lynn Blenkhorn em "Market Watch"</ref>. Charpentier é a fundadora da CRISPR Therapeutics, mas já vendeu os direitos dessa empresa. Várias disputas surgiram por conta destes pedidos de patentes rivais<ref>[http://www.technologyreview.com/featuredstory/532796/who-owns-the-biggest-biotech-discovery-of-the-century/ Who Owns the Biggest Biotech Discovery of the Century?<small> There’s a bitter fight over the patents for CRISPR, a breakthrough new form of DNA editing.</small>] por Antonio Regalado em [[4 de dezembro]] de [[2014]]</ref>. Mais de 100 patentes já foram arquivados por muitos cientistas que fazem uso da tecnologia CRISPR-Cas9. Isso pode levar muitos cientistas em violações de patentes cada vez que produtos CRISPR-Cas9 foram licenciados. Entretanto, para muitos pesquisadores a patente para CRISPR-Cas9 em si  pode ser controversa. Uma vez que a a tecnologia utiliza uma tecnica que já existe em bactérias por milênios, parece ser "óbvio" para muitos cientistas que podem facilmente usá-la em seus laboratórios. Em um sentido CRISPR foi de fato "inventado" pela natureza e não por qualquer indivíduo, assim reivindicando uma patente sobre o mecanismo seria um ato natural da bactéria. Respondendo a uma questão como essa pode ser uma grande dor de cabeça não só para o [[Direito das coisas|campo jurídico]], mas também para a [[bioética]] e a [[filosofia]]<ref>[http://www.nature.com/nbt/journal/v33/n3/full/nbt.3160.html Law, history and lessons in the CRISPR patent conflict] por Shwerkow JS, em "Nature".  Vol 33 (3): 256-257, 2015.</ref>.
-==Investimento==
-Em [[2015]], [[Jennifer Doudna]], um [[bioquímica]] da [[Universidade da Califórnia]] co-fundadora de "Editas Medicine", e sua colaboradora, [[Emmanuelle Charpentier]] do [[Centro Helmholtz para Pesquisa de Infecções]] na [[Alemanha]], receberam $3 milhões de dolares cada uma pela invenção da revolucionária ferramenta para a edição de DNA CRISPR<ref>[https://www.quantamagazine.org/20150206-crispr-dna-editor-bacteria/ Breakthrough DNA Editor Borne of Bacteria] por Carl Zimmer publicado em [[6 de fevereiro]] de [[2015]] na "QUANTA Magazine"</ref>. Em agosto de 2015, [[Bill Gates]] e 13 outros investidores colocaram $120 milhões em "Editas Medicine"<ref>[http://www.forbes.com/sites/matthewherper/2015/08/10/bill-gates-and-13-other-investors-pour-120-million-into-revolutionary-gene-editing-startup/  Bill Gates And 13 Other Investors Pour $120 Million Into Revolutionary Gene-Editing Startup] por Mattheu Herper em [[11 de agosto]] de [[2015]] na revista "Forbes"</ref> e em setembro, Intellia Therapeutics recebeu $70 milhões de investidores. Intellia desenvolveu maneiras de corrigir os genes defeituosos com tratamentos de edição de genes para doenças do [[fígado]] e do [[sangue]]<ref>[https://www.bostonglobe.com/business/2015/09/01/intellia-raises-million-for-gene-editing-treatments/Er3l8K2EEiWlc7m2aoRQgJ/story.html Intellia raises $70 million for gene-editing treatments] por Jack Newsham em [[1 de setembro]] de [[2015] publicado no "Boston Globe"</ref>.
+O sistema do tipo II é comumente encontrado em Archaea e pode ser dividido em 3 subtipos distribuídos de A a C <ref name=":9" />.
-== Notas ==
-{{refbegin}}
+Neste caso, a transcrição do ''locus'' CRISPR é seguida pelo pareamento de bases do tracrRNA à sequência repetida localizada entre os protoespaçadores <ref name=":9" />. A clivagem do dsRNA pela RNaseIII em fragmentos de sequências formadas por um único proto-espaçador <ref>{{Citar periódico|titulo = CRISPR RNA maturation by trans-encoded small RNA and host factor RNase III|url = http://www.nature.com/doifinder/10.1038/nature09886|jornal = Nature|data = 2011-01-01|pmid = 21455174|volume = 471|numero = 7340|doi = 10.1038/nature09886|primeiro = Elitza|ultimo = Deltcheva|coautores = Krzysztof}}</ref> juntamente com a porção 3’ da sequência repetida é denominado crRNA <ref name=":8" />. O tracrRNA se liga à sequência repetida complementar do crRNA e essa molécula híbrida associa-se à nuclease Cas9 para promover o seu direcionamento à sequência apropriada do DNA invasor usando o domínio PAM como guia  <ref name=":8" />. A proteína Cas 9 é constituída por cerca de 800-1400 aminoácidos, com uma estrutura de 2 lóbulos <ref>{{Citar periódico|titulo = Crystal Structure of Cas9 in Complex with Guide RNA and Target DNA|url = http://www.cell.com/article/S0092867414001561/abstract|jornal = Cell|issn = 0092-8674|pmid = 24529477|paginas = 935-949|volume = 156|numero = 5|doi = 10.1016/j.cell.2014.02.001|idioma = English|primeiro = Hiroshi|ultimo = Nishimasu|coautores = F. Ann}}</ref> que possui dois sítios com atividade nuclease: O RuvC-like (RNase-H fold) responsável pela clivagem da sequencia não alvo e o domínio HNH (McrA-like) responsável pela clivagem da sequencia alvo <ref name=":8" />. Posterior ao reconhecimento, a clivagem do DNA invasor mediada pelo complexo Cas9-crRNA-tracrRNA é realizada importante destacar que ao contrario do sistema Tipo I, o reconhecimento do domínio PAM no sistema Tipo II ocorre na mesma fita do crRNA <ref>{{Citar periódico|titulo = A Guild of 45 CRISPR-Associated (Cas) Protein Families and Multiple CRISPR/Cas Subtypes Exist in Prokaryotic Genomes|url = http://dx.plos.org/10.1371/journal.pcbi.0010060|jornal = PLoS Comput Biol|data = 2005-11-11|pmid = 16292354|paginas = e60|volume = 1|numero = 6|doi = 10.1371/journal.pcbi.0010060|primeiro = Daniel H|ultimo = Haft|coautores = Jeremy}}</ref>
-{{Reflist|group=nt}}
-{{refend}}
+'''1.1.3.      Tipo
+III'''
+Sistemas CRISPER CAS Tipo III compreendem dois subtipos, III-A e III-B,
+ambos possuem o gene CAS 10 específico dos sistemas Tipo III, entretanto podem
+ser diferenciados pelos genes acessórios: csm no subtipo III-A e cmr no subtipo
+IIIB <sup>(Marakova
+)</sup>.Além disso, eles
+não requerem domínios PAM para o reconhecimento da sequencia alvo por parte do
+crRNA ou para sua clivagem <sup>(Lundgrenetal 2015)</sup>.A transcrição do locus CRISPR é
+seguida pela ligação do transcrito ao redor de Cas6 e pela clivagem 8
+nucleotídeos a montante da junção entre a sequência repetida e o
+protoespaçador. Isto resulta em uma série de protoespaçadores com sequências
+repetidas nos dois extremos, 5’ e 3’, similar aso Tipo II <sup>(Lundgrenetal 2015)</sup>.Entretanto, enquanto no Tipo II a clivagem é realizada no extremo 5’
+deixando a porção 3’ da sequência repetida ligada ao proto-espaçador, no Tipo
+III a clivagem ocorre no extremo 3’ e deixa cada proto-espaçador com a porção
+’ da sequência repetida <sup>(Lundgrenetal 2015)</sup>.
+No Tipo III-A a maturação do crRNA intermediário é essencial para a
+interferência dirigida. De fato, enquanto os crRNAs intermediários podem ser
+ligados dentro do complexo proteico csm-Cas10 (conforme mencionado abaixo), o
+subsequente complexo ribonucleoprotéico é incapaz de degradar o DNA invasor <sup>(Hatoum-Aslan
+et al. 2014)</sup>.
+No Tipo III-B o crRNA é tomado pelo complexo de proteínas conhecido como
+cmr (módulo Cas RAMP, proteínas misteriosas associadas a repetições) <sup>(Hale''et. al'' 2009)</sup>. Diferentes proteínas
+membros dos módulos RAMP podem ser expressas entre diversas espécies. Os
+complexos cmr usualmente consistem de várias proteínas Cas (tipicamente Cas1-6)
+<sup>(Hale''etal'' 2012)</sup>. De fato,
+existem diversas ''famílias''
+identificadas dos complexos cmr  que
+quando complexadas com Cas10 realizam clivagem de RNA através da interação de
+complementaridade de pares de bases do crRNA com o RNA invasor <sup>(Haftetal
+)</sup>.
+Os sistemas do Tipo III-A são geralmente caraterizados pela presença de
+genes csm (tipicamente csm 2-5 – membros da superfamília RAMP) os quais, da
+mesma forma que os genes cmr, codificam para proteínas envolvidas na formação
+do complexo com Cas10 e subsequente degradação do DNA invasor guiado por crRNA,
+num modo sequência específico <sup>(Lundgrenetal 2015)</sup>.
 {{Referências}}

v d e Biologia
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