Sequenciamento de DNA
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O sequenciamento de DNA (português brasileiro) ou sequenciação de ADN (português europeu) é uma série de métodos bioquímicos que têm como finalidade determinar a ordem das bases nitrogenadas adenina (A), guanina (G), citosina (C) e timina (T) da molécula de DNA.
A montagem do genoma é feito através da união de um grande número de sequências de DNA que são juntadas para criar uma representação do cromossomo original do DNA em estudo. Em um projeto de sequenciamento shotgun, todo o DNA do ser vivo analisado (seja uma bactéria, seja um mamífero) é inicialmente particionado em milhões de pequenos pedaços. Estes pedaços são então "lidos" por máquinas de sequenciamento automático, capazes de ler até 1000 nucleotídeos ou bases de uma só vez. Um algoritmo de montagem de genoma é então utilizado para reunir todas as partes e colocá-las na ordem original, detectando todos os locais onde existe coincidências entre pedaços distintos de DNA. As partes coincidentes podem ser fundidas, unindo dois pedaços de DNA. O processo é repetido até montar a sequência completa. O sequenciamento é um processo computacional difícil pois vários genomas possuem um grande número de sequências idênticas, às vezes com milhares de nucleotídeos, algumas ocorrendo em milhares de locais diferentes.
Métodos de sequenciamento
O método tradicional de sequenciamento de DNA foi proposto por Frederick Sanger na década de 1970 e consiste na adição de nucleotídeos modificados, chamados didesoxirribonucleotídeos, que impedem o crescimento de um fragmento de DNA em replicação pela DNA polimerase após sua adição. Esse método tem sido largamente utilizado por centros de pesquisa ao redor do globo.
O método de pirosequenciamento consiste em uma nova abordagem molecular do sequenciamento e se beneficia de uma técnica capaz de captar a emissão de luz causada pela adição de uma luciferase, acoplada à polimerização do DNA previamente fragmentado e aderido a microesferas, com o uso de sequências adaptadoras.
Método de Sanger
Pelo método de Sanger, uma fita simples de DNA que será sequenciada, é hibridizada com um iniciador de desoxinucleotídeos marcado na ponta 5 (cinco linha). Quatro misturas de reação são preparadas onde os iniciadores utilizados serão elongados por uma DNA polimerase. Cada mistura contém os quatro desoxinucleosídeos trifosfato normais mais um dos quatro didesoxinucleosídeos trifosfato em uma razão de aproximadamente 1/100. Uma vez que um didesoxinucleotídeo não tem ponta 3´-OH, não é possível haver elongação a partir do nucleotídeo adicionado, parando a reação. Desta forma, cada mistura de reação produzirá cadeias prematuramente terminadas de acordo com toda ocorrência de um didesoxinucleotídeo adicionado. Cada mistura é então separada em um gel de sequenciamento por eletroforese para se detectar cada um dos nucleotídeos presentes na sequência de DNA lida.
Pirosequenciamento
Vários novos métodos de sequenciamento de DNA foram desenvolvidos nos anos 1990, incluindo o primeiro método de "nova geração", patenteado por Roger Tsien, Pepi Ross, Margaret Fahnestock e Allan J Johnston.[1]
Em 1996, Pål Nyrén e seu aluno, Mostafa Ronaghi, do Instituto Real de Tecnologia de Estocolmo, publicaram seu método de pirosequenciamento.[2] Em 1º de abril de 1997, Pascal Mayer, Laurent Farinelli e Eric Kawashima requereram na Organização Mundial da Propriedade Intelectual a patente de métodos de sequenciamento de colônias de DNA.[3]
Em 2004, 454 Life Sciences, do grupo Roche, comercializou uma versão alternativa do pirosequenciamento, que permitia sequenciar genomas em menos tempo e a um custo muito mais baixo.[4] A primeira versão reduzia os custos a 1/6 em relação ao método de Sanger.[5]
Referências
- ↑ Tsien base-by-base sequencing patent
- ↑ Ronaghi M, Karamohamed S, Pettersson B, Uhlén M, Nyrén P Real-time DNA sequencing using detection of pyrophosphate release. Analytical Biochemistry vol 242 n° 1 pp 84–9 1996.
- ↑ Kawashima, Eric H.; Laurent Farinelli; Pascal Mayer. «Patent: Method of nucleic acid amplification»
- ↑ Stein RA (1 September 2008). «Next-Generation Sequencing Update». Genetic Engineering & Biotechnology News. 28 (15) Verifique data em:
|data=(ajuda) - ↑ Schuster, Stephan C Next-generation sequencing transforms today's biology Nature Methods, volume 5, n° 1 pp 16–18, janeiro de 2008.
- Darnell, J., Lodish, H., Baltimore, D.. Molecular Cell Biology. 4th edition. Scientific American Books. New York: W. H. Freeman; 2000. ISBN-10: 0-7167-3136-3
