Oligonucleotídeo

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Os oligonucleótidos são moléculas curtas de ácido nucleico (ADN ou ARN), oligómeros, que têm uma ampla gama de aplicações em exames genéticos, investigação e ciência forense. Geralmente produzidos em laboratório por síntese química em fase sólida, estes pequenos pedaços de ácidos nucléicos podem ser produzidos na forma de moléculas de cadeia simples cuja sequência pode ser ajustada por cada usuário e, portanto, são vitais para a síntese artificial de genes, reação em cadeia da polimerase (PCR), sequenciamento de ADN, clonagem molecular e como sondas moleculares. Na natureza, os oligonucleótidos são geralmente encontrados na forma de pequenas moléculas de ARN que têm um papel na regulação da expressão génica (por exemplo, microRNA), ou como intermediários derivados da degradação de maiores moléculas de ácidos nucleicos.

Os oligonucleótidos são caracterizados pela sequência de nucleótidos que constituem toda a molécula. O comprimento do oligonucleótido é geralmente indicado por "-mer" (do grego meros, "parte"). Por exemplo, um oligonucleótido de seis nucleótidos (nt) é um hexâmero, enquanto que um de 25 nt seria normalmente chamado de "25-mer". Os oligonucleótidos ligam-se facilmente, de uma forma específica e dependente sua da sequência, aos seus respectivos oligonucleótidos complementares, ADN ou ARN para formar duplexes ou, menos frequentemente, híbridos de ordem superior. Esta propriedade que lhes é inerente serve como base para o uso de oligonucleótidos como sondas para detectar sequências específicas de ADN ou ARN. Exemplos de técnicas que usam oligonucleótidos incluem microarranjo de ADN, Southern blot, análise de ASO, hibridização in situ fluorescente (FISH), PCR e a síntese de genes artificiais.

Os oligonucleótidos são compostos por 2'-deoxirribonucleótidos (oligodeoxirribonucleótidos) que podem ser modificados na sua estrutura ou na posição 2' do açúcar para obter diferentes efeitos farmacológicos. Essas modificações conferem novas propriedades aos oligonucleótidos e tornam-nos um elemento-chave na terapia antisense.

Síntese[editar | editar código-fonte]

Os oligonucleótidos são sintetizados quimicamente através de blocos de construção. Estes blocos de construção são fosforamidites protegidas constituídas por nucleósidos naturais ou quimicamente modificados, ou por compostos não-nucleosídicos. A síntese de uma cadeia de oligonucleótidos é realizada através de ciclos sintéticos na direção 3' para 5'. Por cada ciclo sintético completo, um nucleótido é adicionado à cadeia. Rendimentos inferiores a 100% em cada um dos passos sintéticos do ciclo, assim como a ocorrência de reações laterais, estabelecem limites práticos na eficiência do processo. Geralmente, as cadeias de oligonucleótidos são curtas, compreendendo entre 13 a 25 monómeros, contudo podem chegar a 200 monómeros.[1] Técnicas de cromatografia líquida de alta eficiência, assim como outros métodos analíticos são utilizados para isolar a sequência desejada.

Modificações Químicas[editar | editar código-fonte]

A síntese de oligonucleótidos curtos quimicamente estáveis foi o primeiro desafio no desenvolvimento de terapias antisense. Os oligonucleótidos naturais são facilmente degradados por nucleases, enzimas que clivam os nucleótidos e amplamente presente em todos os tipos de células.[2] As sequências de oligonucleótidos curtas também têm fracas afinidades de ligação intrínsecas, o que contribui para a sua degradação in vivo.[3]

Modificações no grupo fosfato[editar | editar código-fonte]

Os análogos de organotiofosfato de nucleótidos conferem aos oligonucleótidos propriedades benéficas. A nível sintético, essas propriedades concentram-se na formação de diastereoisómeros de cada nucleótido e uma maior facilidade no acompanhamento das reacções que envolvem nucleótidos fosforotioatos.[4] Por outro lado, a nível biológico, o esqueleto organotiofosfato protege os oligonucleótidos contra a degradaçao enzimática indesejadas.[5] A modificação do esqueleto dos nucleótidos é amplamente utilizada porque pode ser alcançada com relativa facilidade e precisão na maioria dos nucleótidos.[4] A adição de fragmetos flourescentes nas extremidades 3' ou 5' estão descritas na literatura, como forma de avaliar as estruturas, dinâminas e interaçöes dos oligonucleótidos com o ambiente envolvente.[6]

Modificações na pentose[editar | editar código-fonte]

Modificações na posição 2' têm-se demostrado úteis em aplicações medicinais. A modificação na posição 2' da pentose aumenta a eficácia dos oligonucleótidos, reforçando as suas capacidades de ligação ao alvo, espeficicamente nas terapias de oligonucleótidos antisense. Também diminuem a ligação não específica de proteínas, aumentando a precisão de visar proteínas específicas. 2'-O-metilo assim como 2'-O-metoxieltil são as modificações mais frequêntes.[3] Foram também relatadas modificações fluorescentes na nucleobase.[6]

Oligonucleótidos Antisense[editar | editar código-fonte]

Os oligonucleótidos antisense são cadeias simples de ADN or ARN complementares a uma sequência escolhida.[3] No caso do ARN antisense, estes impedem a tradução proteica de certos filamentos de ARN mensageiro ligando-se a eles, num processo chamado hibridização.[7] Os oligonucleótidos antisense podem ser utilizados para um alvo ARN específico, complementar (codificante ou não codificante). Se a ligação ocorrer, este híbrido pode ser degradado pela enzima ribonucelase H.[7] a ribonuclease H é uma enzima que hidrolisa o ARN, e quando usada numa aplicação de oligonucleótido antisense resulta numa diminuição de 80-95% da expressão do mRNA.[1] O uso de oligonucleótidos morfolino antisense para a eliminação de genes em vertebrados, técnica desenvolvida por Janet Heasman, atrés do Xenopus é actualimente uma técnica padrão utilizada em biologia do desenvolvimento. esta técnica é usada para estudar a expressão génica alterada e a função do gene.[7] Os medicamentos Morpholino aprovados pela FDA incluem eteplirsen e golodirsen. Os oligonucleótidos antisense têm ta,bém sido aplicados na inibição da replicação do vírus da gripe em linhas celulares.[8][9]

Técnicas analíticas[editar | editar código-fonte]

Cromatografia[editar | editar código-fonte]

As alquilamidas podem ser usadas como cromatografias de fase estacionária.[10] Estas fases têm sido investigadas para a separação de oligonucleótidos.[11] A cromatografia líquida de alta eficiência de par iónico de fase reversa é usada para separar e analisar os oligonucleótidos após síntese automatizada.[12]

Espectrometria de massa[editar | editar código-fonte]

Uma mistura de ácido 5-metoxisalicílico e espermina pode ser usada como matriz para análise de oligonucleótidos em espectrometria de massa MALDI.[13] A Espectrometria de Massa por Ionização por ElectroSpray (ESI-MS) também é uma ferramenta útil para caracterizar a massa de um oligonucleótido.[14]

Microarranjo de ADN[editar | editar código-fonte]

Microarranjo de ADN são uma aplicação analítica muito útil dos oligonucleótidos. Em comparação com os microarranjo de cDNA padrão, os microarranjo baseados em oligonucleótidos têm uma especificidade mais controlada em relação à hibridação e a capacidade de medir a presença e a prevalência de sequências poliadeniladas ou com splicing alternativo.[15] Um subtipo de microarranjo de ADN pode ser descrito como substratos (nylon, vidro, etc.) aos quais os oligonucleótidos são ligados em alta densidade.[16] Há uma série de aplicações de microarranjo de ADN nas ciências da vida.

Ver também[editar | editar código-fonte]

  • Aptamero, oligonucleótidos com aplicaçöes biológicas importantes.
  • Morfolino, oligonucleótidos com esqueletos näo naturais, que não activam a RNase-H mas podem reduzir a expressäo genética ou modificar o RNA splicing.
  • Polimorfismo, o aparecimento numa população do mesmo gene em múltiplas formas devido a mutações; pode muitas vezes ser testado com sondas ASO.

Referências

  1. ↑ a b Dias N, Stein CA. «Antisense oligonucleotides: basic concepts and mechanisms». Molecular Cancer Therapeutics. 1 (5): 347–55. PMID 12489851 
  2. ↑ Frazier KS. «Antisense oligonucleotide therapies: the promise and the challenges from a toxicologic pathologist's perspective». Toxicologic Pathology. 43 (1): 78–89. PMID 25385330. doi:10.1177/0192623314551840 
  3. ↑ a b c DeVos SL, Miller TM. «Antisense oligonucleotides: treating neurodegeneration at the level of RNA». Neurotherapeutics. 10 (3): 486–97. PMC 3701770Acessível livremente. PMID 23686823. doi:10.1007/s13311-013-0194-5 
  4. ↑ a b Eckstein F. «Phosphorothioate oligodeoxynucleotides: what is their origin and what is unique about them?». Antisense & Nucleic Acid Drug Development. 10 (2): 117–21. PMID 10805163. doi:10.1089/oli.1.2000.10.117 
  5. ↑ Stein CA, Subasinghe C, Shinozuka K, Cohen JS. «Physicochemical properties of phosphorothioate oligodeoxynucleotides». Nucleic Acids Research. 16 (8): 3209–21. PMC 336489Acessível livremente. PMID 2836790. doi:10.1093/nar/16.8.3209 
  6. ↑ a b Michel BY, Dziuba D, Benhida R, Demchenko AP, Burger A. «Probing of Nucleic Acid Structures, Dynamics, and Interactions With Environment-Sensitive Fluorescent Labels». Frontiers in Chemistry (em inglês). 8. 112 páginas. Bibcode:2020FrCh....8..112M. PMC 7059644Acessível livremente. PMID 32181238. doi:10.3389/fchem.2020.00112Acessível livremente 
  7. ↑ a b c Crooke ST. «Molecular Mechanisms of Antisense Oligonucleotides». Nucleic Acid Therapeutics. 27 (2): 70–77. PMC 5372764Acessível livremente. PMID 28080221. doi:10.1089/nat.2016.0656 
  8. ↑ Kumar P, Kumar B, Rajput R, Saxena L, Banerjea AC, Khanna M. «Cross-protective effect of antisense oligonucleotide developed against the common 3' NCR of influenza A virus genome». Molecular Biotechnology. 55 (3): 203–11. PMID 23729285. doi:10.1007/s12033-013-9670-8 
  9. ↑ Kumar B, Khanna M, Kumar P, Sood V, Vyas R, Banerjea AC. «Nucleic acid-mediated cleavage of M1 gene of influenza A virus is significantly augmented by antisense molecules targeted to hybridize close to the cleavage site». Molecular Biotechnology. 51 (1): 27–36. PMID 21744034. doi:10.1007/s12033-011-9437-z 
  10. ↑ Buszewski, Bogusław; Safaei, Zahra; Studzińska, Sylwia (31 de dezembro de 2015). «Analysis of oligonucleotides by liquid chromatography with alkylamide stationary phase». Open Chemistry (em inglês) (1). 000010151520150141 páginas. ISSN 2391-5420. doi:10.1515/chem-2015-0141. Consultado em 28 de fevereiro de 2023 
  11. ↑ Buszewski, B.; Kasturi, P.; Gilpin, R. K.; Gangoda, M. E.; Jaroniec, M. (agosto de 1994). «Chromatographic and related studies of alkylamide phases». Chromatographia (3-4): 155–161. ISSN 0009-5893. doi:10.1007/bf02274494. Consultado em 28 de fevereiro de 2023 
  12. ↑ Gilar, Martin; Fountain, Kenneth J.; Budman, Yeva; Neue, Uwe D.; Yardley, Kurt R.; Rainville, Paul D.; Russell II, Reb J.; Gebler, John C. (junho de 2002). «Ion-pair reversed-phase high-performance liquid chromatography analysis of oligonucleotides:». Journal of Chromatography A (1-2): 167–182. ISSN 0021-9673. doi:10.1016/s0021-9673(02)00306-0. Consultado em 28 de fevereiro de 2023 
  13. ↑ Distler, Anne M.; Allison, John (1 de abril de 2001). «5-Methoxysalicylic acid and spermine: A new matrix for the matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry analysis of oligonucleotides». Journal of the American Society for Mass Spectrometry (4): 456–462. ISSN 1044-0305. doi:10.1016/s1044-0305(01)00212-4. Consultado em 28 de fevereiro de 2023 
  14. ↑ Shah, Samit; Friedman, Simon H (14 de fevereiro de 2008). «An ESI-MS method for characterization of native and modified oligonucleotides used for RNA interference and other biological applications». Nature Protocols (3): 351–356. ISSN 1754-2189. doi:10.1038/nprot.2007.535. Consultado em 28 de fevereiro de 2023 
  15. ↑ Relogio, A. (1 de junho de 2002). «Optimization of oligonucleotide-based DNA microarrays». Nucleic Acids Research (11): 51e–51. ISSN 1362-4962. doi:10.1093/nar/30.11.e51. Consultado em 28 de fevereiro de 2023 
  16. ↑ Gong, Ping; Harbers, Gregory M.; Grainger, David W. (25 de fevereiro de 2006). «Multi-technique Comparison of Immobilized and Hybridized Oligonucleotide Surface Density on Commercial Amine-Reactive Microarray Slides». Analytical Chemistry (7): 2342–2351. ISSN 0003-2700. doi:10.1021/ac051812m. Consultado em 28 de fevereiro de 2023 
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