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Cromatografia de Exclusão por Tamanho (exclusão molecular)
Dentre todos os métodos cromatográficos a Cromatografia de Exclusão por Tamanho (do Inglês Size Exclusion Chromatography) foi a última a ser desenvolvida. A nomenclatura recomendada em português para esse método é cromatograia de exclusão molecular. O primeiro trabalho foi publicado por Plodin em 1959, que utilizou esta técnica para separação de biopolímeros. Para a separação de biomoléculas no sistema aquoso, a cromatografia por exclusão é nomeada de cromatografia de filtração em gel, enquanto a separação de polímeros orgânicos em sistemas não aquosos é chamada de cromatografia de permeação em gel. Para que haja separação é necessário que as massas moleculares dos analitos tenham uma diferença de pelo menos 10%.
O método de separação na Cromatografia de Exclusão por Tamanho, diferentemente das técnicas de cromatografia iônica e por partição (fase normal e fase reversa), não envolve processos químicos nem físicos, somente mecânico. É baseada no efeito de peneiração molecular e torna possível a separação de moléculas de acordo com seus tamanhos. A coluna contém um recheio com poros de vários tamanhos, e o eluente se encontra dentro dos poros e também se movendo através da coluna. Os canais entre as partículas são muito maiores que seus poros. As moléculas de analitos maiores que todos os poros, não penetram em nenhum destes, e são eluídas no volume de exclusão da coluna (vo). As moléculas de analitos menores que todos os poros, durante a eluição, entram em todos os poros, e só são eluídas no limite de permeação da coluna (vt). As moléculas de analitos com massas moleculares intermediárias entram em alguns poros e em outros não. A Figura 6 mostra uma ilustração do processo de separação.
A resolução é baseada no tamanho efetivo das moléculas dos componentes da amostra em solução. E existem limites que determinam o intervalo de tamanhos. O primeiro é o inferior, chamado de limite de permeação, abaixo do qual todas as moléculas de menor tamanho são igualmente difundidas dentro dos poros do material e o segundo é o superior, chamado limite de exclusão, acima do qual todas as moléculas são muito grandes para penetrar nos poros. Moléculas de tamanho intermediário entre ambos os limites serão separadas totalmente ou parcialmente de acordo com a seletividade característica de cada molécula. Então, serão eluídas sem resolução as moléculas menores que o limite de permeação e as maiores do que o limite de exclusão, separando somente as que se encontram dentro destes limites. Desta forma, esta técnica não possui muitos parâmetros a serem ajustados, já que esta não depende do eluente. O eluente só serve para levar as moléculas e evitar interações da amostra com a fase estacionária; não tem a mesma seletividade que em outras técnicas de cromatografia. Para aumentar a resolução deve-se utilizar duas colunas ligadas uma a outra ou aumentar o tamanho da coluna. Em geral, se obtém picos finos, pois a dispersão é baixa e todos os componentes da amostra devem sair entre vo e vt .
O tamanho pode ser estimado de acordo com o tempo que a substância permanece nos poros. O tempo de retenção observado é sempre inversamente proporcional à massa molecular do analito. As moléculas menores, capazes de entrar nos poros menores da coluna, terão tempos de retenção mais longos; moléculas maiores, que são parcialmente ou completamente excluídas, terão os tempos de retenção menores Figura 7.
As matrizes utilizadas são de sílica ou polímeros orgânicos com um maior ou menor grau de entrecruzamento, formando poros de diferentes tamanhos. São hidrofílicas, e assim capazes de absorver água, o que causa a abertura de sua estrutura porosa. As matrizes a base de sílica são mais rígidas, suportam altas temperaturas e alta pressão. Mas, quando se trabalha a níveis de nanogramas, significantes efeitos silanofílicos ocorrem, incluindo a perda do metal na presença de eluentes de baixa força iônica. Já com a matriz a base de polímeros a perda de metal é negligenciável. Durante o processo de fabricação das matrizes, o tamanho e a distribuição das partículas devem ser controlados; partículas menores resultam numa melhor resolução e eficiência, porém, pode haver resistência ao fluxo. Em geral, o tamanho das partículas varia de 5 a 17 µm.
Para a calibração da Cromatografia de Exclusão por Tamanho são utilizados padrões denominados marcadores de massa molecular, que devem possuir massas moleculares diferentes entre si, para que haja separação. Além disso, é desejável que as massas moleculares dos marcadores sejam semelhantes às massas dos analitos. A curva de calibração pode ser construída a partir dos volumes ou tempos de eluição versus massa molecular ou a partir da constante de distribuição (Kav) versus logaritmo das massas moleculares (Da). O uso do segundo método de calibração é necessário quando o objetivo é determinar a faixa de massa molecular das espécies com massas elevadas ou muito próximas. A constante de distribuição do analito no sistema eluente resina, pode variar de 0 até 1, que correspondem a exclusão e permeação totais da coluna; e é calculada pela fórmula:
Kav = ve – v0/vt – v0
ve = volume de eluição
v0 = volume de exclusão da coluna
vt = volume de permeação total
Se o valor de Kav for maior que 1 quer dizer que estão ocorrendo fenômenos além da exclusão por tamanho, como adsorção ou partição. Através da curva de calibração é possível a determinação das massas moleculares de componentes de uma amostra desconhecida, como é mostrado na Figura 8.
Outro mecanismo proposto é o Mecanismo Secundário de Exclusão. Este mecanismo ocorre quando uma amostra contém uma mistura de moléculas pequenas e grandes é aplicada a uma coluna, as moléculas pequenas difundem-se rapidamente dentro dos poros, enquanto que as moléculas grandes encontrarão poucos poros desocupados e irão avançar ainda mais na coluna até encontrar poros desocupados. Isto resulta no melhoramento da separação de pequenas e grandes moléculas.
A Cromatografia de Exclusão por Tamanho pode ser aplicada para separação de compostos com alta massa molecular como polímeros, proteínas e aminoácidos. Além disso, é bastante útil em processos de purificação e dessalinização, em estudos de ligações proteína-ligante e de enovelamento de proteínas, para concentração de amostra, estudos de copolimerização e determinação da massa molecular relativa.
Cromatografia de troca iônica
Nos anos de 1850, é encontrado o documento mais antigo sobre cromatografia de troca iônica. Depois desse ano, cientistas descreveram vários artigos métodos específicos para moléculas diferentes [5].
A partir de 1956 houve uma metodologia otimizada na separação de aminoácidos, mas o sistema tinha baixa pressão da fase móvel e de todo o sistema, pois havia uma amostra complexa de mistura biológica da amostra, e assim a análise podia demorar vários dias.
Com isso o segmento da bioquímica necessitou automatizar técnicas analíticas computacionais, o que se realizou com o desenvolvimento das técnicas de HPLC (High Performance Liquid Chromatography).
Um grande número de fases estacionárias foram desenvolvidas e agora são resistentes à pressão e capazes de otimizar a cromatografia de troca iônica usando alta pressão, propiciando a separação de misturas complexas em um menor tempo de corrida.
A popularização dessa técnica tem aumentado atualmente, devido à técnica possuir capacidade de analisar uma enorme variedade de moléculas em áreas farmacêuticas, biotecnológicas, meio ambiente, agricultura e outros segmentos industriais [2].
Princípio
Cromatografia de troca iônica (IEC) é uma importante técnica analítica para a separação e determinação de compostos iônicos juntos com interação / partição de íons e cromatografia de exclusão de íons [1].
Separação da cromatografia iônica é baseada nas interações eletrostáticas ou iônicas entre analitos iônicos e polares presentes no eluente e os grupos iônicos funcionais fixados no suporte cromatográfico.
A fase móvel é um sistema de tampão aquoso no qual a mistura de íons tem que ser a ideal para o tipo de amostra a ser analisada. A fase estacionária é usualmente feita de uma matriz orgânica e quimicamente inerte com grupos funcionais ionizáveis (Íons fixos que carregam cargas iônicas opostas).
Separação é baseada na ligação de analitos para grupos carregados positivamente ou negativamente que são fixados na fase estacionária e que estão em equilíbrio com íons livres na fase móvel de acordo com diferenças nas suas superfícies carregadas eletricamente [7].
Mecanismos diferentes acontecem com a blindagem, atração de íons competitivos e a exclusão iônica de acordo com a repulsão entre analitos carregados similarmente e os íons fixados no suporte cromatográfico [2].
Aplicação
É a cromatografia mais importante na separação de peptídeos, proteínas, ácidos nucleicos e biopolímeros (moléculas carregadas com tamanhos e naturezas moleculares diferentes) [3].
A separação é baseada na formação de ligações iônicas entre os grupos carregados das biomoléculas e o gel suporte carreador da troca iônica de carga oposta [4].
O princípio é de que na fase móvel há íons trocadores de cargas elétricas, isso é grupo de trocadores de íons são adicionados na resina ou gel e competem por um lugar na superfície da fase estacionária, conforme demonstrados na tabela 1 abaixo: Tabela1 exemplos de trocadores iônicos.
Algumas pré-condições são essenciais para garantir condições ótimas de funcionamento:
-O tipo de trocador iônico,
-O pH da fase móvel,
-A força iônica (concentração) da fase móvel,
-O tipo de troca iônica da fase móvel,
-A densidade eletrônica dos íons envolvidos.
O trocador iônico prefere:
-Íon com maior carga, pois tem maior quantidade de cargas concentradas em sua eletrosfera,
-Íon com menor diâmetro, pois suas cargas positivas do núcleo do átomo agem com maior intensidade na ionização de outros íons,
-Íon com maior polarizabilidade (grande potencial para mover a carga elétrica, melhor capacidade de indução de dipolo). Íons que podem ser prontamente polarizáveis são chamados de levemente polarizáveis e íons que não são tão fáceis de dificilmente polarizáveis.
Importante
-Trocadores iônicos com base de sílica se dissolvem em pH abaixo de 1 e maiores do que 9.
-Ácidez forte dos trocadores catiônicos (pH abaixo de 2 ) ou fortemente básicos dos trocadores aniônicos (pH acima de 10) podem catalisar reações laterais.
A cromatografia de troca iônica, também conhecida como cromatografia de adsorção, é um método útil e popular com [8]:
-alta capacidade de resposta
-alto poder de resolução
-condições de separar detalhadamente a amostra
-relativo custo baixo
Componentes gerais básicos
-Bomba com alta pressão e indicador de fluxo para controlar o eluente
-Um injetor para carrear a amostra no fluxo do eluente e para a coluna
-Uma coluna para separar a mistura de amostra em componentes individuais
-Um forno opcional
-Um detector para medir os espectros (picos) do analito, conforme o eluente sai da coluna
-Um sistema de dados (computador) capaz de coletar, organizar, integrar os dados do cromatograma
Resumindo:
Reservatório com solvente – Bomba – Indicador de fluxo e pressão – Unidade de injeção (auto-amostrador) – Coluna – Detector – Processador de dados
Condutor de condutividade é o mais comum usado na cromatografia de troca iônica na parte da detecção. Entretanto lâmpada de UV e outros detectores também podem ser utilizados [6].
Pode ser utilizada na separação e purificação de muitas moléculas carregadas ou ionizáveis tais como proteínas, peptídeos, enzimas, nucleotídeos, DNA, antibióticos, vitaminas entre outras substâncias de fontes naturais ou origem sintética.
Conforme houve o aumento do interesse pela cromatografia líquida por causa do aumento da demanda pela indústria farmacêutica, aumentou a necessidade de se ter métodos cromatográficos mais precisos nas técnicas de isolar moléculas bioativas de diferentes fontes [9].
Cromatografia de troca iônica tem muitas vantagens, a técnica é facilmente transferida para escalas de produção com baixo custo, altos níveis de purificação podem ser atingidos na etapa de purificação com a molécula desejada [8].
Ainda é alvo de contínuos desenvolvimentos e otimizações de metodologias e novas tecnologias.
[1] Haddad PR, Jackson PE. Journal of Chromatography Library – Volume 46 Ion Chromatography. Amsterdam: Elsevier Science; 1990.
[2] Bhattacharyya L, Rohrer JS. Applications of Ion Chromatography for Pharmaceutical and Biological Products. New Jersey: John Wiley & Sons; 2012.
[3] Okada T. Nonaqueous ion-exchange chromatography and electrophoresis Approaches to nonaqueous solution chemistry and design of novel separation. Journal of Chromatography A 1998; 804 17-28.
[4] Stanton P. HPLC of Peptides and Proteins. Methods in Molecular Biology. New Jersey: Humana Press; 2004.
[5] Wisel A, Schmidt-Traub H, Lenz J, Strube J. Modelling gradientelution of bioative multicomponent systems in non-linear ion-echange chromatography. Journal of Chromatography A 2003; 1006 101-120.
[6] Fritz JS, Gjerde DT. Ion Chromatography (Fourth Completely Revised and Enlarged Edition). Weinhein: Wiley-VCH Verlag GmbH &KGoA Weinhein; 2009.
[7] Kastner M. Protein Liquid Chromatography. Amsterdam: Elsevier Science;2000.
[8] Westerlund B. Ion-exchange Chromatography in Simpson RJ. Purifying Proteins for Proteomics. New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press; 2004.
[9] Gerberding SJ, Byers CH. Preparative Ion-echange chromatography of proteins from dairy whey. Journal of Chromatography A 1998; 808 141-1511.
[10] Boletim da Sociedade Portuguesa de Química, 39, 1990.
[11] Methods Development Using Ion-Pair Chromatography with Suppressed Conductivity Detection – Dionex Technical Note 12
Cromatografia de Par Iônico
A Cromatografia de Par Iônico não é mais que uma modificação engenhosa da Cromatografia de Fase Reversa, resumindo-se a utilizar-se no eluente uma solução de molaridade próxima a 0,005 M de fosfato de tetrabutilamônio (separação de ácidos orgânicos) ou de ácidos alquilsulfônicos de cadeias lineares de 5, 6, 7 ou 8 átomos de carbono (separação de bases orgânicas).
Como é fácil de concluir, ácidos e bases não interagem facilmente com a superfície hidrofóbica das colunas de fase reversa (especialmente C18), devido à carga associadas a estas espécies; com a adição à fase móvel dos sais referidos, de carga contrária a das moléculas da amostra, permite-se que as mesmas e o sal reagente formem um par eletronicamente neutro, podendo então interagir com a fase estacionária por um mecanismo de partição. Os modelos químicos das reações de par iônico são:
— ácidos (meio básico):
R-COO(-) + (+)N (C4H9)4 <—> [R-COO(-)(+)N(C4H9)4]
(ác. orgânico) (reagente PIC) (par iônico)
— bases (meio ácido):
R-NH3(+) R'S03(-) <—> R-NH3(+)(-)S03-R1
(amina) (reagente PIC) (par iônico)
O comprimento da cadeia dos ácidos alquilsulfônicos é um fator a considerar: quanto maior a cadeia, maior a retenção, ou seja, se utilizarmos como reagente PIC o ácido octasulfônico (C8H17SOOH), este originará uma maior retenção dos compostos básicos da amostra do que a que se originaria ao utilizar o ácido pentanosulfônico (C5H9SOOH), sendo desta forma um fator de controle da separação. Outros fatores que podem ainda influenciar a separação serão a concentração do sal reagente, o pH da fase móvel e o tipo e a concentração do tampão a utilizar.[10]
A cromatografia de par iônico representa uma alternativa para a cromatografia de troca iônica. Muitos problemas podem ser resolvidos por qualquer um dos métodos, mas a troca iônica não é tão boa para separar misturas de produtos ácidos, básicos e neutros sob certas circunstâncias, e aí é onde a cromatografia de pareamento iônico aparece e se destaca. O fato de que as fases reversas podem ser usadas como fases estacionárias aumentou sua popularidade. (MEYER,2010)
Amostras iônicas podem ser separadas por cromatografia de fase reversa ,uma vez que elas contenham apenas ácidos fracos ou bases fracas (além de compostos neutros) presentes na forma não dissociada, como determinado pelo pH escolhido; o que é conhecido como “supressão iônica”.
A cromatografia de par iônico é uma extensão deste princípio. Uma substância orgânica iônica é adicionada à fase móvel e forma um par iônico com o componente da amostra de carga oposta. De fato, este par é um sal, mas seu comportamento cromatográfico é de uma molécula orgânica não iônica:
amostra+ + contra-íon- --> par [ amostra+ contra-íon- ]
amostra- + contra-íon+ --> par [ amostra- contra-íon+ ]
A cromatografia em fase reversa pode ser usada nesta situação. Um alquilsulfonato é adicionado a amostras catiônicas e fosfato de tetrabutilamonio para amostras aniônicas. Uma amostra contendo componentes tanto catiônicos quanto aniônicos terá um componente “mascarado” pelo contra-íon e o outro suprimido por um nível adequado de pH. (MEYER, 2010)
Nota: o processo não pode ser usado com ácidos e bases fortes porque estes estão dissociados por uma ampla faixa de pH e seria necessário níveis de pH extremos para a supressão iônica.
Vantagens da Cromatografia de Par Iônico
As vantagens da cromatografia de par iônico para a separação de amostras iônicas podem ser sumarizadas a seguir:
(a) os sistemas cromatográficos de fase reversa podem ser usados para a separação;
(b) misturas de produtos ácidos, básicos e neutros, como também moléculas anfotéricas (que possuem um grupo catiônico e um grupo aniônico) podem ser separadas;
(c) a seletividade pode ser influenciada pela escolha do contra-íon;
A cromatografia de par iônico é adequada para todos os compostos iônicos, mas nem todos os contra-íons são bons em todos os casos.
A tabela abaixo lista alguns contra-íons adequados para cromatografia de fase reversa com metanol-água ou acetronitrila-água de fase móvel:
TABELA 1 – Aplicabilidade dos diferentes contra-íons (MEYER,2010)
Reagentes de par iônico
Há duas regras simples ao escolher o reagente de par iônico. A primeira regra é que íons hidrofílicos são melhor separados usando um reagente de par iônico hidrofóbico e que analitos hidrofóbicos são melhor separados com um reagente de par iônico hidrofílico. Reagentes comuns estão listados abaixo por ordem crescente de hidrofobicidade:
• Para análise de ânions, reagentes de par iônico incluem amônia e tetrametil-, tetraetil-, tetrapropil-, e tetrabutilamônio.
• Para análise de cátions, reagentes de par iônico incluem ácidos clorídrico, perclórico, e perfluorocarboxílicos e ácidos pentano-, hexano-, heptano-, e octano-sulfônicos. Ácidos perfluorocarboxílicos possuem a vantagem da baixa condutância e estão disponíveis com pureza extremamente alta; eles são úteis para a separação de cátions muito hidrofóbicos. [11]
Concentração do Reagente
Devido a capacidade efetiva de a coluna ser determinada principalmente pelo reagente de par iônico, a retenção do analito aumentará na medida em que a concentração do reagente é aumentada. Entretanto, a repulsão eletrostática das moléculas do reagente na superfície da fase estacionária em última análise irá limitar o quanto a capacidade da coluna pode ser aumentada. A concentração do reagente de par iônico é também limitada pela capacidade do supressor. As concentrações de trabalho típicas variam de 0.5 a 20 mM. [11]
Há um bom número de misturas reagentes em soluções tampão disponíveis no mercado, embora muitos pesquisadores/analistas prefiram preparar seus próprios “coquetéis” de fase móvel para adequar a seu problema em particular. Alguns exemplos são listados a seguir:
(a) Fosfato de tetrabutilamonio, +N(C4H9)4, tamponado a pH 7,5, forma pares com ácidos fortes e fracos e o tamponamento suprime os íons básicos;
(b) Ácidos alquilsulfônicos, -SO3(CH2)nCH3 com n = 4-7, tamponado a pH 3,5, forma pares iônicos com bases fortes e fracas e o tamponamento suprime os íons ácidos fracos. Quanto maior a cadeia alquila, maior é o tempo de retenção.
Moléculas anfotéricas, tais como o ácido p-aminobenzoico (H2NC6H4COOH, onde o NH2 é a função básica e o COOH é a função ácida), podem ser cromatografadas com ambos os reagentes citados acima. A função ácida forma par iônico com o primeiro grupo e o grupo amino permanece indissociado como resultado do tamponamento. O inverso se aplica ao segundo grupo de reagentes.
Os únicos problemas são causados pelas misturas de ácidos fortes e fracos com bases foretes e fracas. Ou as bases fortes ou os ácidos fortes estão na forma iônica. Entretanto, este tipo de mistura é raro.
Os valores de k’ são proporcionais a concentração do contra-íon, de modo que os tempos de retenção são afetados não somente pelo tipo mas também pela concentração do reagente de par iônico. Sob certas circunstâncias, podem ser usados dois reagentes ao invés de um, para otimizar um problema de separação, p.ex. uma mistura de ácidos pentano- e octanosulfônico. Claro, os tempos de retenção também podem ser ajustados alterando-se a quantidade de solvente orgânico na fase móvel e outros procedimentos de otimização, incluindo a adição de compostos competidores.
Sais quaternários de amônio em meio alcalino são extremamente danosos para a sílica. É altamente recomendado em tais situações, o uso de uma coluna de saturação, colocada na frente do injetor, na qual a fase móvel é saturada com sílica. (MEYER, 2010)
Orientações para a cromatografia de pareamento iônico
(a) Recomenda-se que seja usada quando outros métodos tais como os modos cromatográficos fase reversa e supressão iônica tenham falhado ou quando a amostra contenha tanto componentes não-iônicos quanto iônicos;
(b) Recomenda-se usar uma mistura metanol-água como fase móvel, minimizando assim problemas de solubilidade do contra-íon. A acetonitrila é preferida se a seletividade não for satisfatória, mas as propriedades de solubilidade podem ser diferentes neste caso;
(c) A escolha do contra-íon correto é importante, com as variedades de cadeia curta sendo preferidas para amostras com bem pouca diferença na estrutura molecular e as variedades de cadeia longa, hidrofóbicos, preferidos se uma retenção maior é requerida.
(d) A solubilidade do contra-íon deve ser checada para todas as proporções de mistura da fase móvel possíveis durante a análise (eluição por gradiente);
(e) Recomenda-se que o pH da fase móvel seja escolhido de forma a prover a maior ionização da amostra, Entretanto, deve-se levar em consideração também a compatibilidade da sílica, como base da fase estacionária, ao pH (2-7,4);
(f) Recomenda-se escolher uma fase reversa monomérica de C18 ou C8 para o teste inicial. Parece faltar estabilidade a cadeias alquilas menores;
(g) Recomenda-se degaseificar a fase móvel antes da adição do contra-íon, para prevenir a formação de espuma (especialmente relevante quando compostos de cadeia longa, similares a detergentes são usados);
(h) Concentração: recomenda-se que o reagente de par iônico seja usado no intervalo de 50-200mM (preferencialmente uma concentração mais baixa se um contra-íon de cadeia longa é utilizado e vice-versa). Se houver a necessidade de usar solução tampão para manter o pH no nível requerido, então quantidades iguais devem ser adicionadas a todos os solventes envolvidos no caso de eluição por gradiente. Recomenda-se que os componentes do tampão seja pobre como par iônico, mas tenha boa solubilidade.
(i) Em termos de otimização da separação por gradiente, mudança no contra-íon ou nas concentrações do tampão, se a amostra contém tanto componentes iônicos quanto não iônicos, então os não-iônicos devem ser otimizados primeiro e deve-se buscar um contra-íon que elua os íons a tempos de retenção favoráveis;
(j) Recomenda-se não desligar as bombas enquanto houver contra-íon na tubulação e na coluna. À noite, o fluxo pode ser reduzido para 3-5 ml h-1 para prevenir a precipitação de sal;
(k) É necessário verificar a transparência ao UV dos contra-íons.
Três dicas adicionais:
(l) Amostras maiores são melhor separadas se a amostra está na forma de par iônico antes da adição na coluna. Uma quantidade aproximadamente estequiométrica de contra-íon é adicionada à solução da amostra com este propósito, tomando-se o cuidado de assegurar a máxima ionização pelo ajuste do pH;
(m) Como regra geral, os reagentes de par iônico costumam ser danosos à silica da coluna;
Recomenda-se reservar colunas com o propósito estrito de serem usadas para cromatografia de pareamento iônico. (MEYER,2010)
Cromatografia de fase reversa
A cromatografia de fase reversa é uma técnica cromatográfica que separa componentes de uma mistura pela diferença de hidrofobicidade entre cada um deles . Nesse caso, a fase estacionária é mais hidrofóbica que a fase móvel, logo, resultando em uma retenção forte com analitos hidrofóbicos. A separação pode ser realizada tanto por eluição isocrática quanto por gradiente, separando com alta resolução componentes com pequena diferença de hidrofobicidade.
Como a cromatografia de fase reversa separa componentes de uma amostra por polaridade, moléculas polares são eluídas primeiro, preparações podem ser purificadas, concentradas e dessalinizadas em uma única corrida cromatográfica, fazendo dessa técnica uma alternativa ideal para ser acoplada com espectrometria de massas e cromatografia líquida multidimensional.
Funcionamento da cromatografia de fase reversa
A separação de moléculas na cromatografia de fase reversa é realizada por uma interação hidrofóbica e reversível, entre as moléculas do analito e da fase móvel. Inicialmente, a fase móvel é polar, fazendo com que a área hidrofóbica do eluente voltada para a fase móvel seja minimizada, favorecendo a interação com a fase estacionária apolar. Quanto mais apolares forem as moléculas do eluente, maior será o tempo de retenção.
A cromatografia de fase reversa têm sua resolução e eficiência altamente influenciadas pelo empacotamento da coluna cromatográfica. A seletividade é influenciada pelo gradiente e pela escolha da fase móvel e da fase estacionária.
Componentes de uma cromatografia de fase reversa
Fase estacionária
Dois tipos de fase estacionária são comuns em cromatografia de fase reversa: Matriz de sílica e matriz polimérica.
Matriz de sílica
Matrizes de sílica foram desenvolvidas com o objetivo de purificar moléculas orgânicas e posteriormente, para peptídeos, aproveitando-se da estabilidade química da sílica para os valores de pH dos solventes normalmente utilizados em cromatografia de fase reversa. Normalmente, as cadeias n-carboxílicas aonde ocorrem as interações são ligadas à matriz via grupos silanol (SiOH).
Matriz de polímero
É uma matriz de polímeros (baseados em poliestireno, por exemplo) com estabilidade química mesmo à valores de pH extremos. São normalmente utilizados para separar misturas de proteínas ou peptídeos. Como a matriz de polímeros pode ser mais organizada que a matriz de sílica, apresenta taxas de fluxo maiores e a grande faixa de pH permite um melhor controle sobre a seletividade.
Fase móvel
Cromatografia de adsorção
A cromatografia de adsorção é um procedimento no qual uma solução de substâncias a separar se desloca numa direção predeterminada por uma disposição de aparatos, por meio de uma fase sólida, insolúvel, inorgânica ou orgânica, sendo os componentes retidos em medida individualmente distinta. Em geral, na cromatografia de adsorção empregam-se como adsorventes óxidos, óxidos hidratados ou sais.
A mistura de substâncias atravessa a fase sólida, finamente dividida, sendo que cada componente da mistura percorre uma distância por ser menos ou mais retido na superfície do sólido. A escolha do dissolvente baseia-se, em geral, no fato de que as substâncias em questão podem eluir-se bem com os mesmos solventes ou misturas de solventes que as dissolvem bem.
Cromatografia Preparativa
A técnica de cromatografia líquida de alta eficiência é comumente utilizada para identificar e quantificar substâncias. Como ocorre a separação é possível à alteração do sistema e suas escalas para que seja possível a coletar ao final da corrida cromatográfica, amostras em quantidades suficientes para análises posteriores tornando assim um sistema de purificação de amostra.
A cromatografia líquida preparativa é utilizada para o isolamento e purificação produtos químicos e farmacêuticos assim como na área de biotecnologia e bioquímica. Dependendo da área de trabalho a quantidade de composto para isolado muda drasticamente entre ug ate mg como no isolamento de enzimas em biotecnologia, neste escala de micro purificação, e para identificação e elucidação de estrutura de compostos desconhecidos com na síntese de produtos naturais, é necessário obter compostos puros em quantidades que variam de um ou mais miligramas.
Para realizar a cromatografia preparativa é necessária a utilização de equipamento cromatográfico que comporte uma grande quantidade de amostras. No entanto, um cromatógrafo preparativo convencional é geralmente menos complexo do que o cromatógrafo analítico.
Reservatórios de solventes
O reservatório de solvente é geralmente feito de vidro ou de aço inoxidável e deve ter uma capacidade adequada. Devido a quantidade maior de solvente que são empregadas na análise preparativa os reservatórios são maiores. Em geral, as maiorias das peças de um cromatógrafo preparativo são feitas a partir de aço inoxidável, no entanto, para substâncias biologicamente sensíveis, o uso de materiais biocompatíveis pode ser necessário para certas partes do aparelho.
Bombas para análise preparativa
A bomba deve ter capacidade adequada, diâmetro, as taxas de bombeamento de pelo menos 150 ml / min. Para colunas maiores, taxas de bombeamento de 500 ml a 1 litro por min. podem ser necessárias. Devido à força limitada de colunas com grande diâmetro pressões maiores de 6000 psi não são muito utilizadas. Em cromatografia preparativa, a amostra é, geralmente introduzida na coluna por uma bomba separada que tem seu próprio reservatório de amostra.
Detectores para cromatografia preparativa
Os detectores para cromatografia preparativa podem ser destrutivos ou não, quando destrutivos, é preciso usar uma válvula de separação da amostra antes do detector. Assim uma pequena quantidade de amostras vai para o detector e a outra, maior, vai para o coletor de amostra. É interessante que o detector utilizado não seja muito sensível, pois as amostras são muito mais concentradas do que em cromatografia analítica.
Coletores de Frações
A maior diferença entre a cromatografia líquida analítica e a preparativa é o que acontece com a amostra, após a saída da coluna. Considerando que a amostra segue diretamente para o recipiente de resíduos na cromatografia líquida analítica, na cromatografia preparativa existe o coletor de frações. O coletor de frações desvia o fluxo para um recipiente, usando uma válvula de desvio que pode ser ligada, por exemplo, por programação de tempo ou com base no sinal do detector. A amostra é recolhida como uma solução com a fase móvel e recuperada por evaporação.
Aspectos gerais de um HPLC
O princípio básico da cromatografia é a separação de misturas, no qual os componentes a serem separados são distribuídos entre duas fases, uma fase estacionária e uma fase móvel, como mostrado na figura 1.
Entre os diferentes tipos de cromatografia, a cromatografia líquida de alta eficiência tem sido amplamente utilizada como uma ferramenta na bioquímica e análise de separação, identificação e quantificação de compostos ativos.[1] Um esquema simplificado de um HPLC está descrito na figura 2.
Um cromatógrafo líquido de alta eficiência é composto da seguinte configuração básica:
- Reservatório de solventes;
- Desgaseificador de solventes;
- Válvula de gradiente;
- Câmara de mistura da fase móvel;
- Bomba de alta pressão;
- Válvula na posição de injeção; 6'. Válvula na posição de carregamento;
- Alça de amostragem;
- Pré-coluna;
- Coluna;
- Detector;
- Aquisição de dados;
- Coletor de resíduo.
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